[发明专利]改进的色谱树脂、其生产和应用

权利要求书

1.一种生产亲和色谱树脂的方法，所述树脂包含作为亲和配体的N-末端断裂内蛋白片段，该方法包括以下步骤：

a) 在细菌细胞的包涵体中作为不溶性蛋白表达N-末端断裂内蛋白片段；

b) 收获所述包涵体；

c) 溶解所述包涵体并释放表达的蛋白；

d) 将所述蛋白结合在固体载体上；

e) 重折叠所述蛋白；

f) 从固体载体释放所述蛋白；和

g) 将所述蛋白作为配体固定在色谱树脂上，以形成亲和色谱树脂。

2. 依据权利要求1的方法，其中N-末端断裂内蛋白片段包含选自SEQ ID NO: 1-5的序列，或与其具有至少95%同源性的序列。

3. 依据权利要求1或2的方法，其中所述色谱树脂上的配体密度是2-10 mg配体/ml树脂，优选≥3 mg配体/ml树脂，最优选≥5 mg配体/ml树脂。

4.依据权利要求1、2或3的方法，其中所述色谱树脂选自琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、甲基丙烯酸酯珠或纤维素珠，优选琼脂糖珠。

5.依据上述权利要求的一项或多项的方法，其中步骤g)中的固定通过共价连接进行。

6. 依据上述权利要求的一项或多项的方法，其中在所述固定之前通过浓缩使蛋白浓度在5-30 mg/ml之间。

7.依据上述权利要求的一项或多项的方法，其中色谱树脂被填充到柱、流化床、多孔整料或毛细管床中。

8.依据上述权利要求的一项或多项的方法，其包括在步骤d)中使N-末端片段结合在离子交换柱上。

9.依据上述权利要求1-7的一项或多项的方法，其中N-末端片段被标记，优选被聚组氨酸标记，和步骤d)中的固体载体是IMAC柱。

10. 一种重组NpuDnaE N-片段蛋白/配体，其选自SEQ ID NO: 1-5或与其具有至少95%同源性的序列。

11. 一种亲和色谱树脂，其中选自SEQ ID NO: 1-5或与其具有至少95%同源性的序列的N-末端断裂内蛋白片段已经以2-10 mg/ml，优选≥3 mg/ml，最优选≥5 mg/ml的配体密度共价连接于树脂。

12.依据权利要求11的色谱树脂，其中树脂包含多孔珠，优选琼脂糖珠。

13. 依据权利要求11或12的色谱树脂用于蛋白纯化的用途，其包括在所述提供有重组NpuDnaE N-片段配体的亲和树脂上捕获重组NpuDnaE C-片段标记的靶蛋白，接着改变条件以促进无标记靶蛋白释放到液体洗脱液中，而NpuDnaE C-片段标记和NpuDnaE N-片段配体保持复合并结合于所述色谱树脂。

14. 依据权利要求13的用途，其中色谱树脂在使用苛刻条件，例如0.05-0.5 M NaOH清洗后重复使用。

15. 依据权利要求13或14的用途，其中NpuDnaE C-片段标记是无C-末端6组氨酸的SEQID NO: 6，和NpuDnaE N-片段配体选自SEQ ID NO: 1-5，优选SEQ ID NO:5。