[发明专利]用于高空间分辨率地确定样品中的分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的方法

说明书

在一种用于高空间分辨率地确定在样品中在一个或多个空间方向(x，y)上的分离的分子(24)的位置的方法的情况下，其中，分子(24)能够以激励光激励以发射发光，使激励光以以下强度分布对准样品：所述强度分布具有零点(20)和在空间方向(x，y)中的每个上在两侧邻接零点(20)的强度上升区域。对于样品中的零点(20)的不同位置(A‑D)中的每个记录由分子(24)发射的发光；由对于零点(20)的不同位置(A‑D)记录的发光的强度推导出样品中的分子(24)的位置。在此，零点(20)布置在样品中的不超过n×3个不同位置(A‑D)处，以便由对于零点(20)的不同位置(A‑D)记录的发光的强度推导出在n个空间方向上的分子(24)的位置。

技术领域

本发明涉及一种用于高空间分辨率地确定样品中在一个或多个空间方向上分离的分子的位置的方法，其中，可以以激励光激励分子以发射发光。

在此，“分离的、以激励光可激励以发射发光的分子”理解为如下分子：所述分子与其他同类型分子具有最小间距，可以以相同的激励光激励所述其他同类型分子以发射相同波长范围内的发光。如果分离的分子与这种同类型分子之间的间距至少等于在发光波长情况下的衍射极限，那么可靠地保持所述最小间距，因为可以分离地检测由以激励光可激励以发射发光的不同分子的发光。然而，本发明也包括以下实施方式：在所述实施方式的情况下所述最小间距小于在发光波长情况下的衍射极限。

发光——分子以激励光可激励以发射所述发光——尤其可以是荧光。然而，通过分子发射发光可以基于通过激励光激励的任何光物理过程。这些包括光致发光(Photolumineszenz)的所有过程并且例如也包括通过激励光激励地发射通过量子点的发光。

背景技术

用于确定分离的、以激励光可激励以发射发光的分子的位置的最简单方法是以激励光激励分子以发射发光以及将发光成像到摄像机上或通常成像到空间分辨探测器上。原则上，在发光波长情况下的衍射极限适用于在所述成像时可实现的空间分辨率。然而，如果借助空间分辨探测器探测到发光的多个光子，所述多个光子来自于在样品中的固定位置处的唯一的分子，那么由所述光子在探测器上的空间分布以改善了因子的精度确定分子的位置。在此，“n”是所记录的光子的数量。因此，在这种称为“定位”的方法中明显地低于衍射极限以发光的由分离的分子发射并且记录的多个光子为前提。因此存在以下风险：分离的分子在以期望的精度确定其在样品中的位置时暗淡并且可能在以期望的精度确定其在样品中的位置前已经暗淡。因此，如跟踪在样品中运动的分子所需的那样，通常不能够实现重复地确定相同的分离的分子的位置。

当分离的分子发射具有定向的空间分布的发光时，这在由发光的光子在空间分辨探测器上的分布(例如通过定位)确定其位置的情况下以位置误差的形式产生影响。所述位置误差取决于分子在相应的样品中的取向。所发射的发光的定向分布例如示出，对于其旋转扩散时间长于其在分子的激励状态下的停留持续时间的分子，所述分子从激励状态发射发光(参见Engelhardt，J.等人的《Molecular Orientation Affects LocalizationAccuracy in Superresolution Far-Field Fluorescence Microscopy》，NanoLett 2011年1月12日；11(1)：209-13)。