[发明专利]用于细胞冷冻保存的组合物和方法

说明书

本发明提供了一种用于细胞冷冻保存的组合物，其包含渗透性冷冻保护剂、糖类和大分子。冷冻保存组合物对细胞和组织具有低毒性，并且在冷冻保存期间促进生物材料的存活和活性保留。

相关申请的交叉引用

本申请要求美国临时申请62/405,447(2016年10月7日提交)和62/404,170(2016年10月4日提交)的优先权，其全部内容通过引用并入本发明。本申请还涉及2017年10月4日提交的名称为“用于维持细胞存活率的组合物和方法”的国际申请PCT/CN2017/，其全部内容通过引用并入本发明。

技术领域

本发明主要涉及冷冻保存领域。特别地，本发明涉及用于冷冻保存诸如细胞和组织的生物材料的组合物和方法。

背景技术

0℃或0℃以下的冷冻保存技术通常用于长期保存生物材料，例如：动物(包括人类细胞和组织)和植物的细胞和组织。请参阅Thompson等人,Cryopreservation and Thawingof Mammalian Cells,December 2014,eLS,John Wiley&Sons,Ltd:Chichester.DOI:10.1002/9780470015902.a0002561.pub2。有效长期储存这些哺乳动物细胞对于可否将这些细胞成功的应用于临床和作为研究工具是至关重要的。举例来说，干细胞可应用于细胞移植、组织工程和再生医学。而冷冻保存的卵母细胞、精子和胚胎则可用于辅助生殖技术。在移植医学中，需要冷冻保存如皮肤、眼角膜、胰岛和心脏瓣膜等活体组织。

已经表明，细胞内冰形成和渗透不平衡可在冷冻过程中损伤细胞。Gao等人，Mechanisms of Cryoinjury in Living Cells,ILAR Journal,2000,41(4):187-196。为了避免这种情况，冷冻保护剂(CPA)被用于在冷冻期间保持细胞和组织的活力。冷冻保护剂被表征为三个主要的化学类别：多元醇(例如二醇、甘油)、酰胺和亚砜。常用的冷冻保护剂包括甘油、二甲基亚砜(DMSO)和聚乙二醇(PEG)。此外，可以加入一些添加剂，例如大分子和糖，以进一步减少冷冻保存期间对细胞和组织的损害。

在这些冷冻保护剂中，DMSO具有高细胞渗透性，并且是最有效且经常采用的。然而，DMSO具有生理毒性，并且已知当将细胞输注给受体时会引起高血压、恶心和呕吐。此外，在将解冻的细胞培养或输入受体体内后，DMSO的毒性趋于使细胞的存活率和/或功能衰弱。

缓慢冷冻和玻璃化是生物材料冷冻保存的两种传统方法。在缓慢冷冻期间，将细胞冷却至略低于其平衡冰点的温度，并将冰接种在细胞外介质中。当细胞外溶液中形成冰时，外部溶质浓度逐渐增加。结果，细胞脱水，细胞质的熔点降低，并且避免了细胞内冰的形成。玻璃化的定义是样品的粘度达到足够高的值以表现得像固体但没有结晶。参见Principles of Cryopreservation,Methods in Molecular Biology,vol.368:Cryopreservation and Freeze-Drying Protocols,Second Edition,Humana Press Inc。如果快速冷却，可以在大多数液体中诱导这种玻璃样状态。添加冷冻保护剂可降低所需的高冷却速率。

用于冷冻保存哺乳动物细胞的常规技术通常与减少在临床或研究环境中细胞的潜在使用的缺点相关。因此，需要改进的冷冻保存介质和冷冻保存生物材料的方法。

发明内容

本发明提供了保存组合物(例如，冷冻保存组合物)，其包含：(1)约2％(w/v)至约40％(w/v)的渗透性冷冻保护剂；(2)约0.1M至约1M的糖类；和(3)约1％(w/v)至约10％(w/v)的大分子，其中单位％(w/v)和单位M基于保存组合物(例如，冷冻保存组合物)的总体积。