[发明专利]突变丝状菌和使用其制造C4二羧酸的方法

说明书

本发明提供一种C4二羧酸生产能力提高的突变丝状菌和使用该突变丝状菌生产C4二羧酸的方法。一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。

技术领域

本发明涉及突变丝状菌以及使用其制造C4二羧酸的方法。

背景技术

C4二羧酸除了作为酸化剂、抗菌剂、pH调节剂用于食品工业中的各种用途之外，也可用作合成树脂和可生物降解聚合物的原料，是一种具有高工业价值的物质。C4二羧酸在工业上通过衍生自石化原料的化学合成或通过微生物发酵生产。过去，化学合成因其成本较低而是主流，但近年来，从原料价格上升、环境负担等观点出发，以再生资源作为原料的微生物发酵的制造方法受到关注。

已知富马酸是C4二羧酸之一，可以使用根霉属菌(Rhizopus)等发酵菌制造。根霉属菌用葡萄糖作为碳源生产富马酸，并将其排出菌体外。迄今为止，关于使根霉属菌的富马酸高产化的方法，已知有通过改良培养方法和诱变育种来生产高产菌株等。然而，由于根霉属菌的遗传学背景还没有得到充分的研究，通过基因重组开发根霉属菌的富马酸高产技术并不容易，报告也很少。有少量报告，通过将源自酿酒酵母的编码丙酮酸羧化酶的基因导入戴尔根霉(Rhizopus Delemar)的方法(专利文献1)、以及将源自大肠杆菌的编码磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶的基因导入米根霉(Rhizopus oryzae)的方法(非专利文献1)以提高富马酸生产能力。

苹果酸酶(malic enzyme，ME)是通过与NAD⁺或NADP⁺的还原共轭而使苹果酸氧化脱羧，生成丙酮酸和二氧化碳的酶。ME除了存在于大肠杆菌的细胞质中之外，还发现存在于链球菌(Streptococcus)属、念珠菌(Candida)属、慢生根瘤菌(Bradyrhizobium)属，棒状杆菌(Corynebacterium)属、以及含油酵母、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)属和高山被孢霉(Mortierella alpine)属等脂质生产菌中，有报告其参与光合作用、脂质合成、能量代谢等各种代谢通路。在非专利文献2中报告了在导入苹果酸酶基因sfcA的大肠杆菌中，琥珀酸的产生量增加。专利文献2中报告了在敲除了fum基因而使苹果酸酶基因过表达的大肠杆菌中，苹果酸产量增加。另一方面，ME在根霉属菌等丝状菌的代谢通路中的作用仍然未知。

现有技术文献：

专利文献1：中国专利申请公开第103013843号说明书

专利文献2：中国专利第101255405号公报

非专利文献1：Metabolic Engineering,2012,14:512-520

非专利文献2：Biotech.Bioeng.,2001,74:89-95

发明内容

在一个实施方式中，本发明提供了一种突变丝状菌，其中，选自以下的至少一种多肽的表达增强：

由序列号2所示的氨基酸序列构成的多肽；

由与序列号2所示的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽；以及

由相对于序列号2所示的氨基酸序列缺失、取代、添加或插入了一个或多个氨基酸的氨基酸序列构成、并且具有苹果酸酶活性的多肽。

在另一个实施方式中，本发明提供一种C4二羧酸的制造方法，其中，包括培养上述突变丝状菌的步骤。

在另一个实施方式中，本发明提供一种突变丝状菌的制造方法，其中，包括在宿主丝状菌中增强选自以下的至少一种多肽的表达的步骤：