[发明专利]包括双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物

说明书

本发明涉及包括sh(FABP4+FABP5)双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物以及利用其的肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗，更详细地，所述基因递送复合物包括：靶向脂肪细胞的序列；九聚精氨酸(R9)肽；以及包括肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因的双质粒载体，所述肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗基因是抑制FABP4基因及FABP5基因的基因表达的碱基序列。本发明为治疗肥胖疾病，制备了能够同时抑制FABP4基因及FABP5基因的双质粒载体，并将其结合至向脂肪细胞特异性递送的特定递送体中而提供基因递送复合物，从而，仅指向脂肪细胞，不存在细胞毒性的同时具有优秀的肥胖治疗效果。

技术领域

本发明涉及包括sh(FABP4+FABP5)双质粒载体的靶向脂肪细胞的非病毒性基因递送复合物以及利用其的肥胖和肥胖诱导的代谢综合征的治疗。

背景技术

为替代传统的蛋白质治疗方法，已经开发出许多基因治疗方法，然而仍然存在需要解决的问题，其中之一是需要实现在最小细胞毒性下的通过质膜(在动物细胞中)和核膜的有效的基因注入(influx)。

基因治疗体系大体能够分为病毒载体介导的体系和非病毒载体介导的体系。使用逆转录酶病毒(retrovirus)或腺病毒(adenovirus)等构建的病毒载体，其优点是能够高效地转染(transfection)到细胞中，然而，具有在体内(in vivo)的免疫原性问题及与基因重组相关的内在问题。为克服这种病毒载体的稳定性问题，已经开发多种等效异位基因递送系统作为传统基于病毒载体的基因递送方法的替代方案。然而，等效异位基因递送系统具有例如内体逃逸(endosomal escape)和核定位(nuclear localization)的细胞内转运(trafficking)障碍的问题。由此，病毒载体具有免疫应答、自我复制，体内稳定性等问题，而通常的等效异位高分子载体的生物相容性低，由此导致细胞及生物毒性大，核酸递送效率低的问题。

一方面，基于合成多肽的基因递送系统在低pH下，引发在内体膜中的基因泄漏，由此使得DNA缩合，并且通过促进内体逃逸，能够克服等效异位基因递送系统的上述问题。基于此，已经开发出多种合成肽以在体外(in vitro)促进在数种细胞系中的基因递送。然而，这些合成肽在体内(in vivo)应用中仍存在毒性和血清不稳定性的问题。

对此，正在进行有关利用短阳离子肽的载体的研究，然而，仍存在一些问题，例如DNA在细胞外空间不稳定，以及与DNA的复合物的稳定性差和基因表达水平不充分的问题。进一步地，需要开发一种特定细胞的特异性基因递送载体，具有靶向特定细胞的能力，从而有利于DNA到靶向细胞中的注入以及DNA从复合物的释放，由此，提高期望基因的表达水平。

一方面，当靶细胞是脂肪细胞、特别是成熟的肥胖脂肪细胞时，上述细胞是最终分化的细胞，因此具有难以转染的问题。在现有研究中已经使用电穿孔法来转染脂肪细胞，然而，所报道的转染效率仅为约10％。此外，上述方法还没有尝试在体内(in vivo)基因递送系统中选择性地将基因递送到目标脂肪组织。

与此相关，本发明人根据通过将靶向脂肪细胞的序列(adipocyte targe tingsequence，ATS)及特定肽序列的复合物与成熟脂肪细胞中表达的阻抑素(prohibitin)结合，能够有效地将基因递送至脂肪细胞，研发出了非病毒性的靶向脂肪细胞的基因递送系统(韩国授权专利公报第10-1447901号)。例如，在上述文献中说明了以下内容：对于ATS序列及R9序列的复合物，将对脂肪酸结合蛋白质(fatty acid binding protein,FABP)进行编码的FABP4基因结合为shRNA的形态的基因递送复合物。

与此相关，目前公开有九种的FABP基因，其中，FABP4在脂肪细胞内对脂肪酸的转运与储存起到核心的作用。由此，在前述专利文献1中进行了如下尝试，即在制备包括shFABP4基因的基因递送复合物之后，通过在脂肪细胞内抑制FABP4的表达而实现肥胖治疗效果，然而，并未观察到充分的体重减少效果。由此，需要开发出使用非病毒性的靶向脂肪细胞的基因递送系统，获得有效的肥胖治疗效果的技术。