[发明专利]包括具有FC结合能力的融合蛋白的胞外囊泡的用途

说明书

本发明涉及用于各种各样的研究、诊断、成像和治疗应用中的工程化胞外囊泡(EV)。所述EV被工程化以使能够并入和表面展示各种关注的蛋白，所关注的蛋白本质上可以是外源性的和/或内源性的。通过EV多肽的发明性蛋白质工程化来实现EV的涂覆，并且本发明因此涉及用于涂覆EV的方法、EV本身、以及试剂盒、检测方法、诊断应用、基于所述工程化EV的成像和递送方法。

技术领域

本发明涉及胞外囊泡，所述胞外囊泡被工程化以作为用于例如标准化和评估针对EV表征的测定、诊断各种疾病的研究和诊断工具和作为用于例如流式细胞术的生物参比材料(RM)起作用。

背景技术

胞外囊泡(EV)是通过EV产生的细胞释放到胞外环境中的纳米尺寸的囊泡。已经示出EV以及具体地外排体能够转运蛋白质生物如抗体和诱饵受体，从而实现利用EV特性结合重组蛋白的特异性的先进的生物治疗剂的完全新颖的形式。此外，已证明取决于其起源和生物体的疾病状态的不同质量的EV的存在以及对特定类型或质量的EV在诊断方面的检测的后续值。受此大量不同的电位应用的触发，已建立或正在建立旨在设定大小、枚举和表型EV的许多分析方法。这种方法包含流式细胞术、光散射、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和/或在结合不同探针之后对荧光进行的检测。

人体液中的EV的分子含量和浓度已经升高，从而提高对其用作生物标志物的用途的关注(Fais等人，2016)。仍未完全实现基于EV的生物标志物，部分是因为缺乏标准化。标准化很难，因为仪器校准、结果解释和验证以及测量的比较需要具有与EV的特性等同或非常类似的参比材料(RM)。最多分析的EV样本的特性之一是浓度。然而，所测得的EV浓度取决于EV的物理特性，如下文进一步说明的大小分布和屈光指数(RI)，这使分析复杂化。

小于300nm的EV构成EV群体的大多数(Aatonen等人，2014)。EV的典型大小分布以约30nm开始，这展现出直径＜100nm的峰值，并且随后是直径＞100nm的减小的幂律函数或指数函数(van der Pol等人，2016)。除了透射电子显微术(TEM)之外，当前的分析方法均不能检测EV的整个群体(van der Pol等人，2016)。无法检测最小的EV导致所确定的浓度的差异和低估。因此，所报道的正常人血浆中的EV的数量在10⁴mL-1到10¹²mL-1的范围内(vander Pol等人，2014a)。EV浓度中的这8个数量级差异强调了对标准化的需求。

流式细胞术是EV研究中最常用的方法之一(Lacroix等人，2010)，在流式细胞术中，颗粒检测通常基于光散射。因为二氧化硅(1.45)和聚苯乙烯珠(1.61)的RI比天然存在的EV的平均RI(约1.39)高，对二氧化硅或聚苯乙烯珠的散射信号施加栅极将导致对EV大小和浓度的错误估计(van der Pol，2012，2014b)。例如，对散射与约500nm的EV相同量的光的200nm的聚苯乙烯珠设置较低大小的栅极(Chandler等人，2011)导致排除在200nm与500nm之间的EV(van der Pol等人，2014b)。由于EV的浓度随直径增大而降低，因此聚苯乙烯大小栅极通常导致对实际EV浓度的低估。

在纳米颗粒跟踪分析(NTA)的情况下，斯托克斯-爱因斯坦方程用于从其布朗运动推导出流体动力学直径(Dragovic等人，2011)。尽管在NTA中EV的RI不影响所测得的直径，但是EV大小分布和RI影响所测得的浓度(Filipe等人，2010)，因为所测得的浓度取决于散射颗粒的亮度。

总而言之，这些实例强调对开发具有类似的RI和大小分布、而优选地还具有类似于所研究的EV的形态学(对于TEM)和ζ电位(对于可调电阻脉冲感测，TRPS)的RM的迫切需求。最后，其它RM特性还将与EM的那些特性相匹配，包含表面分子或内部运载。这是极具挑战性的，因为针对EV研究的最佳RM的开发和用于其检测的分析方法彼此依赖。进一步地，不同的分析技术取决于EV的不同特性。