[发明专利]用于纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法

说明书

本文报道了通过阳离子交换色谱法从反应副产物或未反应的原料中纯化包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质的方法。已经发现，通过应用阳离子交换SP‑650色谱材料和应用第二洗涤步骤，所述第二洗涤步骤与第一洗涤步骤相比具有增加的pH值，可以在单个步骤中以高纯度和收率以及用于大规模应用的适合性获得促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的融合蛋白质。

本文报道了使用阳离子交换色谱材料的单一柱方法来纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法。

发明背景

蛋白质在当今的医疗产品中具有重要作用。对于人应用而言，每种治疗性蛋白质必须符合独特的标准。为了确保生物药物活性剂对人类的安全性，特别必须除去生产过程中累积的副产物。为了满足管理规范，在生产过程之后必须进行一个或多个纯化步骤。其中，纯度、处理量和收率在确定适宜的纯化方法中起重要作用。

已经报道了下述治疗性蛋白质的缀合物：例如，聚乙二醇(PEG)和白介素-6(EP 0442 724)，PEG和促红细胞生成素(WO 01/02017)，包含内皮生长抑素和免疫球蛋白的嵌合分子(US 2005/008649)，基于分泌型抗体的融合蛋白质(US 2002/147311)，包含白蛋白的融合多肽(US 2005/0100991；人血清白蛋白US 5,876,969)，聚乙二醇化的多肽(US 2005/0114037)和促红细胞生成素融合物。

Necina,R.等人(Biotechnol.Bioeng.60(1998)689-698)报道了用表现出高电荷密度的离子交换介质从细胞培养物上清液中直接捕获人单克隆抗体。在WO 89/05157中，报道了通过对细胞培养基直接进行阳离子交换处理来纯化免疫球蛋白产物的方法。Danielsson,A.等人，J.Immun.Meth.115(1988)79-88描述了从小鼠腹水中一步纯化单克隆IgG抗体。在WO 2004/024866中报道了通过离子交换色谱法来纯化多肽的方法，其中使用梯度洗涤将目标多肽与一种或多种污染物拆分开。在EP 0 530 447中，报道了通过三个色谱步骤的组合来纯化IgG单克隆抗体的方法。Yu,G.等人,Process Biotechnol.42(2007)971-977报道了单聚乙二醇化的白介素-1受体拮抗剂的容易的纯化。Wang,H.等人，Peptides 26(2005)1213-1218报道了通过两步阳离子交换色谱法来纯化在大肠杆菌(E.coli)中表达的hTFF3。Yun,Q.等人(Yun,Q.等人,J.Biotechnol.118(2005)67-74)报道了通过两个连续的离子交换色谱步骤来纯化聚乙二醇化的rhG-CSF。

在WO 2012/035037中报道了在SP Sephacryl S 500HR柱中纯化聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法。

WO 1999/057134报道了通过离子交换色谱法进行蛋白质纯化。

在WO 2009/010270中报道了用于纯化单聚乙二醇化的促红细胞生成素的方法，该方法包括两个阳离子交换色谱步骤，其中在阳离子交换色谱步骤中使用了相同类型的阳离子交换材料。

发明概述

本文报道了通过阳离子交换色谱法从反应副产物或未反应的原料中纯化包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质缀合物的方法。

已经发现，通过应用具有增加的pH的洗涤溶液的洗涤步骤，可以通过采用阳离子交换色谱材料例如SP-650，在单个步骤中以高纯度和收率、以改进的和简化的方式获得包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的缀合蛋白质。

已经发现，与包含促红细胞生成素和单个聚(乙二醇)残基的蛋白质缀合物的纯化方法相比，其采用两个顺序阳离子交换色谱步骤，产率和质量至少相当或更好。一个柱处理允许获得相同的质量，同时增加处理的稳健性。它还降低了制造成本和生产时间。可以增加最终产率而不损失单聚乙二醇化的促红细胞生成素的质量。