[发明专利]用于单分子检测的条件性引物延伸

说明书

在一些实施方案中，本公开提供了用于单分子检测的方法和组合物。

相关申请

本申请依照35U.S.C.§119(e)要求2016年5月27日申请的美国临时申请号62/342,401的权益，所述申请以其整体通过引用并入本文。

联邦资助的研究

本发明在美国国防部海军研究办公室授予的N00014-13-1-0593和N00014-14-1-0610以及国立卫生研究院授予的EB018659和国家科学基金会授予的CCF-1317291下的政府支持下进行。政府在本发明中具有某些权利。

背景

单分子检测方法已变为用于分析由复杂生物系统中的组分集合掩盖的单个分子的有力工具。这些方法可用于在疾病早期阶段期间检测与许多疾病相关的疾病生物标志物，其中治疗具有改善预后和存活率的最大潜力。尽管能够检测单一分子具有重要意义，但这样做仍然是一个挑战，特别是以高通量和多重测定形式。

概述

在一些实施方案中，本文提供了用于从生物样品鉴定和定量靶分析物(例如蛋白质)的方法、组合物和试剂盒，其具有检测单一分子(例如，蛋白质或核酸)的灵敏度水平。本公开的方法使用结合和非结合部分之间的相互作用次数的差异，以仅当两个核酸探针识别相同的靶标时生成可扩增的核酸分子(图1)。

可以例如使用核酸探针对检测单一靶蛋白质(参见例如，图2)。第一核酸探针与识别靶蛋白质上的第一表位的第一抗体缀合。第一核酸探针包含(i)5'配对结构域，其包含与3'条形码亚结构域‘UMI’(独特分子标识符)连接的5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2’，其中3'条形码亚结构域‘UMI‘通过缺乏A、T、C或G之一的核苷酸的序列和核苷酸的互补序列之间的碱基配对形成，和(ii)3'未配对的引物-结合结构域‘a’，其中对应于从3'条形码亚结构域(UMI)缺乏的核苷酸的核苷酸位于3'条形码亚结构域(UMI)和5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2‘之间，且其中5'引物-结合亚结构域‘PCR引物2‘包含终止聚合的5'分子。第二核酸探针与识别靶蛋白质上的第二表位的第二抗体缀合。第二核酸探针包含与3'引物结构域(‘a*’，其与第一核酸探针的3'未配对引物-结合结构域‘a’互补)连接的5'引物-结合结构域‘PCR引物1‘。

本公开的方法利用链置换机制来仅当两个核酸条形码化探针共定位于其靶标上时生成可扩增的核酸分子(参见例如，图3)。“链置换”是指当邻近单一互补核酸链(或链的片段)时具有相同序列的两个核酸链对于该互补链经历相对快速(例如，时间尺度1s)竞争的机制，假定通过“随机-行走”机制从互补体中彼此‘置换’(参见，例如，Yurke等人,Nature406:605-608,2000；和Zhang等人Nature Chemistry 3:103-113,2011，其各自通过引用并入本文)。

当核酸探针对共定位于其靶标上时，第一探针中的结构域’a‘结合第二探针中的结构域’a*’。在dATP、dTTP和dCTP存在的情况下，链置换聚合酶沿着链延伸，直至其到达由黑点表示的“终止”分子。该延伸导致新形成的UMI结构域附加至引物结构域’a*’。探针保持与其靶标结合，这允许附加至引物结构域’a*’的新形成的UMI结构域与第一探针的UMI结构域竞争结合其互补结构域。引物结构域’a*’中新形成的UMI结构域置换第一探针的UMI结构域，并且在dGTP存在的情况下，链置换聚合酶沿着引物结构域‘a*’延伸。该延伸将第二引物结合结构域‘PCR引物2‘附加至引物结构域“a*”。所得核酸提供可扩增的记录物，其用于检测靶蛋白质的存在。