[发明专利]使用搅拌槽生物反应器的多能干细胞扩增和传代

说明书

本文提供包含干细胞和/或分化的细胞的细胞聚集体的扩增和传代的新方法，所述方法包括使用在搅拌槽生物反应器中的封闭系统。本发明的方法允许具有相关的多能标记和分化潜能的多能干细胞和/或其子代的封闭系统连续传代扩增。

背景

本公开内容一般涉及使用搅拌槽生物反应器使细胞和/或细胞聚集体扩增和传代。

对于在多能干细胞建库(如，对于诱导的多能干细胞)、细胞(如，GE的CytivaTM心肌细胞)的商业生产和用于临床试验的细胞扩增中的应用，对大规模多能干细胞培养的需求正逐渐显现出来。无饲养细胞的多能干细胞培养的进展使得在烧瓶中，在生物反应器中的微载体(直径150-250微米)或宏载体(直径~6 mm)上的大规模细胞扩增成为可能。使用悬浮液培养避免在传统微载体上培养多能细胞时出现的一些难题，包括无效率的接种和从载体释放细胞，在收获期间微载体和细胞的物理分离，和可导致细胞表型改变的细胞-载体结块的形成。通常地，灌注被用于在生物反应器中的悬浮液培养。

然而，灌注/悬浮液培养中的一个难题是如何在生物反应器中保留细胞。现有技术提供一些基本的分离技术：1) 过滤，2) 重力沉降，和3) 离心。过滤方法需要一些方式来防止过滤器在需要的数周操作中堵塞。重力沉降的问题是不同细胞的变化的沉降特性，扩大到工业系统的困难，和维持无菌性的困难。类似地，在开放细胞培养中常规使用离心，但已发现由于关于无菌性的顾虑导致在完全封闭系统细胞培养中有限的应用。

本领域需要在培养细胞，包括多能干细胞和/或分化的人细胞的过程中减少人为干预和交叉污染的技术。

发明简述

本文描述了用于培养细胞，包括多能干细胞和/或分化的人细胞的改进的方法。

本文提供了在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

细胞培养容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；和

在封闭系统中收获聚集体和传代。

本文还提供在使用本文描述的方法扩增细胞聚集体中使用的封闭系统。

附图

当参考附图阅读以下详细描述时，本发明的这些和其它特征、方面和优点将变得更好理解，其中在整个附图中相同的字符代表相同的部件，其中：

图1显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中用过的培养基以垂直方向从生物反应器中移除。

图2显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中新鲜培养基以垂直方向被加入到生物反应器中。

图3显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中用过的培养基以倾斜的方向从生物反应器中移除。

图4显示了搅拌槽生物反应器中用于重力沉降和培养基交换的管道组件的图，其中新鲜培养基以倾斜的方向被加入到生物反应器中。

图5显示具有100um-300 um厚度的10 mm切片机网格结构的图。

图6显示在壁之间间隔100um和具有30 um壁厚的方形网格切片机的图。

图7显示在壁之间间隔100um和具有30 um壁厚的六边形网格切片机的图。

图8显示通过切片机对聚集体进行封闭系统处理的方法图。由泵驱动的循环回路和在线锥形袋悬浮和分布聚集体。导向切片机的管道连接到主循环回路，和一部分细胞聚集体通过以较低速度运行的第二个泵被传递到切片机。

图9显示CT2人胚胎干细胞的切开的聚集体的形态学图像。