[发明专利]使用搅拌槽生物反应器的多能干细胞扩增和传代

权利要求书

1.一种在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

提供细胞培养容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；和

在封闭系统中收获聚集体和传代。

2.权利要求1的方法，其中在封闭系统中传代在Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂的存在下进行。

3.权利要求1的方法，其中在封闭系统中传代基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下进行。

4.权利要求3的方法，其中维持多能细胞的成活力的试剂是Rho-相关蛋白激酶(ROCK)抑制剂。

5.以上权利要求的一项或多项的方法，其中扩增的细胞聚集体包含人多能干细胞。

6.以上权利要求的一项或多项的方法，其中细胞培养容器是搅拌槽生物反应器。

7.以上权利要求的一项或多项的方法，其中所述自动灌注在封闭系统中在没有人为干预的情况下进行。

8. 以上权利要求的一项或多项的方法，其中重力沉降室的长度是至少1 cm且定位在驱动细胞聚集体的重力沉降的方向。

9.以上权利要求的一项或多项的方法，其中自动灌注以允许约100微米-约800微米直径的细胞聚集体重力沉降的速率进行。

10.以上权利要求的一项或多项的方法，其还包括通过执行连续传代，对细胞聚集体或其子代进行一次或多次额外扩增。

11.以上权利要求的一项或多项的方法，其中细胞聚集体的连续传代能够在封闭系统中使用切片机网格，通过无酶传代进行。

12.权利要求11的方法，其中细胞聚集体用具有刀片的切片机网格离解，所述刀片分隔约20-约500微米的距离，例如约100微米的距离。

13.权利要求11或12的方法，其中细胞聚集体用对齐管道的切片机网格和用于混合细胞聚集体的装置离解。

14.权利要求11、12或13的方法，其中切片机用疏水性材料涂布或包含疏水性材料。

15.以上权利要求的一项或多项的方法，其中每个扩增的细胞聚集体的平均直径大小不超过约800微米，例如大小不超过约500微米。

16. 以上权利要求的一项或多项的方法，其中培养容器的体积是约50 mL-约100 L。

17.一种在封闭系统中扩增细胞聚集体的方法，其包括

提供搅拌槽生物反应器容器；

在容器中形成聚集体；

在容器中自动灌注细胞聚集体；

在灌注过程中重力沉降细胞聚集体；

收获聚集体和无酶切割细胞聚集体；和

在封闭系统中传代。

18.权利要求17的方法，其中在封闭系统中传代基本上在维持传代的、单分散的或解聚的多能细胞的成活力的试剂不存在下进行。