[发明专利]生成无载体诱导多能干细胞的载体和方法

权利要求书

1.一种生成基本上不含重编程载体的诱导人类多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：

(a)将重编程载体导入人类体细胞以生成第一细胞群，其中，所述重编程载体包括病毒复制起点，编码iPSC重编程因子、合成转录因子或两者的表达盒，以及自杀基因；

(b)培养所述第一细胞群以实现重编程因子、合成转录因子或两者的表达，从而生成具有与胚胎干细胞一致性状的第二细胞群；

(c)将所述第二细胞群与自杀基因底物接触以生成基本上不含重编程载体的iPSC。

2.如权利要求1所述的方法，其中，所述自杀基因选自胸苷激酶和胞嘧啶脱氨酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中，所述复制起点是OriP。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述表达盒包括多核苷酸，其编码EBV的EBNA-1，缺失EBNA-1残基65-89的EBNA-1衍生物，缺失EBNA-1残基90-328的EBNA-1衍生物，或缺失EBNA-1残基65-328的EBNA-1衍生物。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述体细胞选自人外周血单核细胞、成纤维细胞、角化细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞，胃细胞和β细胞。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述iPSC重编程因子选自Sox-2、Oct-4、Nanog、KLF4、cMYC、Lin-28和p53DD中的一种或多种。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述iPSC重编程因子选自Sox-2、Oct-4或Sox-2和Oct-4两者。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中，所述重编程因子包括Sox-2，Oct-4以及KLF4、cMYC、Lin-28和p53DD中的一种或多种。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其还包括：(d)就所述附加型重编程载体的存在筛选(c)中所述细胞群。

10.如权利要求9所述的方法，其还包括：(e)培养(d)中筛选的不含所述附加型重编程载体的细胞。

11.如权利要求9-10中任一项所述的方法，其中，所述筛选包括qPCR载体检测试验。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其还包括在步骤(b)之后步骤(c)之前继代培养所述第二细胞群。

13.如权利要求12所述的方法，其中，所述继代培养后，在不进一步的传代的情况下进行步骤(c)。

14.一种生成基本上不含附加型重编程载体的诱导人类多能干细胞(iPSC)的方法，其包括：

(a)将附加型重编程载体导入体细胞以生成第一细胞群，其中所述附加型重编程载体包括：

(i)OriP复制起点，

(ii)编码iPSC重编程因子、合成转录因子或两者的表达盒，

(iii)多核苷酸，其编码EBV的EBNA-1，缺失EBNA-1残基65-89的EBNA-1衍生物，缺失EBNA-1残基90-328的EBNA-1衍生物，或缺失EBNA-1残基65-328的EBNA-1衍生物，和

(iv)胸苷激酶或胞嘧啶脱氨酶自杀基因；

(b)培养所述第一细胞群以实现重编程因子、合成转录因子或两者的表达，从而生成具有与胚胎干细胞一致性状的第二细胞群；

(c)将所述第二细胞群与自杀基因底物接触以生成基本上不含附加型重编程载体的iPSC。

15.如权利要求14所述的方法，其中，所述体细胞选自人外周血单核细胞、成纤维细胞、角化细胞、造血细胞、间充质细胞、肝细胞，胃细胞和β细胞。