[发明专利]用于生产活性肝细胞生长因子(HGF)的方法

说明书

【问题】提供一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性肝细胞生长因子激活物(HGFA)和一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性肝细胞生长因子(HGF)的方法。【解决方案】本发明涉及一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性HGFA的方法。该方法的特征在于其包括通过在无血清的培养基中对能够表达无活性肝细胞生长因子激活物(前‑HGFA)的哺乳动物细胞进行培养以获得包含前‑HGFA的培养上清液的步骤，和将包含在上述步骤中获得的前‑HGFA的培养上清液调节至弱酸性值以将前‑HGFA转化为活性HGFA的步骤。本发明还涉及一种使用通过上述方法生产的HGFA来生产活性HGF的方法。

技术领域

本发明涉及一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性肝细胞生长因子激活物(在本文中也称为“活性HGFA”)和活性肝细胞生长因子(在本文中也称为“活性HGF”)的方法。

背景技术

HGF是从人类暴发型肝炎患者的血浆中纯化的、具有肝实质细胞增殖活性的因子(专利文献1和非专利文献1)，并且已经被报道具有各种药理学效果，例如抗肿瘤效果、增强细胞介导的免疫、伤口治疗效果和组织再生促进效果(专利文献2)。

迄今为止，已经通过重组DNA技术克隆并产生了编码上述HGF的基因(专利文献3-5)。此外，已知HGF呈单链和双链形式，其由2种类型的亚基构成(大约60kDa的α链和大约30kDa的β链)，其中单链形式不具有生物活性并以双链形式获得生物活性。此外，已知在通过重组DNA技术的生产中，HGF可以在用动物血清的培养中作为活性双链形式获得，但是在不用动物血清的培养中，生产的大部分HGF是作为无活性单链形式获得的(例如，专利文献6)。由于动物血清中含有的蛋白酶参与从单链无活性肝细胞生长因子形式(在本文中也称为“前HGF”)到双链活性HGF形式的转化，因此认为有必要使用动物血清以有效获得活性HGF。

另一方面，近年来，通过重组DNA技术生产生物材料的主流是在没有动物血清的情况下进行培养以避免病毒污染等风险。因此，为了用无动物血清的培养基生产活性HGF，有必要通过一些手段将单链前-HGF形式转化为活性HGF。已知可以将前-HGF转化为活性HGF的HGFA(专利文献7)、或丝氨酸蛋白酶如尿激酶型纤溶酶原激活物(非专利文献2)是此类手段。然而，存在如下问题：可以将前-HGF转化为活性HGF的这些酶是血清来源的，并且当需要通过将基因整合到微生物或动物细胞中进行生产来生产这些酶时，它们作为前体形式在无血清培养中生产并且因此难以原样使用。

引用列表

专利文献

[专利文献1]日本公开的未经审查的专利申请公开号S63-22526

[专利文献2]日本专利号2747979

[专利文献3]日本专利号2577091

[专利文献4]日本专利号2859577

[专利文献5]日本专利号3072628

[专利文献6]日本专利号3213985

[专利文献7]日本公开的未经审查的专利申请公开号H5-103670

非专利文献

[非专利文献1]J.Clin.Invest.[临床研究杂志]，81，414(1988)

[非专利文献2]JGH[JGH杂志]26(2011)增刊1；188-202，第192页

发明内容

发明欲解决的问题

本发明的目的是提供一种用于在不使用动物血清的情况下生产活性HGFA和活性HGF的方法。

本发明的另一个目的是提供通过本发明的方法生产的活性HGFA、活性HGF及其制剂。

解决问题的技术手段