[发明专利]一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用

说明书

本发明涉及基因治疗领域，尤其涉及一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示，本发明采用了目前最高效的CRISPR/Cas9基因编辑工具，所设计的HIF‑1α基因sgRNA位点具有优于以往研究所报道的其他位点的基因敲除活性，首次联合TAE/TACE手术，用于HCC肿瘤治疗。

技术领域

本发明涉及生物基因治疗领域，尤其涉及一种sgRNA及其构建的慢病毒载体和应用，具体涉及一种表达CRISPR/Cas9并靶向敲除HIF-1α基因的慢病毒的构建和其联合肝脏动脉栓塞术，用于人肝脏肿瘤患者的临床治疗应用。

背景技术

作为世界第五大恶性肿瘤，肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma，HCC)的致死率在所有肿瘤中排名前三，在近几十年来HCC的治疗形势并不乐观。HCC约占原发性肝癌比例的85％到90％，数据显示2012年全球新增肝癌患者782,500例，有745,500例患者死于肝癌。目前，临床用于肝癌治疗的技术包括手术切除、原位肝移植等。研究表明50％的肝癌患者由于发现过晚，并不适合使用这些传统方法。巴塞罗纳临床分析系统(Barcelona clinicliver cancer staging system，BCLC)指出对于HCC晚期B期并不能进行手术治疗的患者，其建议治疗使用肝脏动脉栓塞术(transarterial embolization，TAE)，包括肝动脉化疗栓塞术(transarterial chemoembolization，TACE)。

目前，研发新的治疗肝脏肿瘤的药物十分迫切。临床上，TAE是将包括化疗药物等在内的混合材料注入HCC肿瘤动脉内，阻断肿瘤营养供应，导致肿瘤组织局部缺血、缺氧及坏死等，达到抑制肿瘤生长的目的。研究表明TAE/TACE能够有效控制HCC的生长和延长肝癌患者的生命时间。然而，TAE术后的HCC患者容易出现肿瘤复发、转移和令人担忧的预后。研究表明这些不良后果与缺氧环境下的肿瘤改变有关。这就需要一些新的方法或技术来改进目前的TAE/TACE治疗手段，特别是限制HCC缺氧条件下的肿瘤血管新生成和肿瘤转移等。虽然，近年来以基因治疗和免疫治疗为代表的肿瘤治疗手段获得巨大突破。然而其高价的花费、冗长的时间消耗以及复杂的实施策略使其成为现有临床广泛普通患者使用方案的可能性有待提高。为此，利用现有新技术对现有临床可行的HCC治疗手段(包括TAE)进行的改进成为一种迫切需求和可供发展的选择。

近来，利用基因编辑技术对人基因组进行改造获得了很大进步，特别是在转化医学领域。CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9编辑技术就是当前最前沿与成熟的基因编辑技术之一。具体来说，CRISPR/Cas9蛋白是一类来源于细菌或古细菌体内用于获得性免疫应答的核酸内切酶类。它能够在一个短的向导RNA(short guide RNA，sgRNA)指导下靶向特定DNA位点并完成基因编辑。在生物技术层面上，CRISPR/Cas9及sgRNA能够通过慢病毒等工具载体导入并表达在目的细胞内，CRISPR/Cas9在sgRNA的指导下靶向目的DNA位点。此刻，DNA双链将被CRISPR/Cas9蛋白切开，并缺失部分DNA序列并彻底改变核酸编码序列，目的基因将发生移码突变而不能行使正常功能。为此，CRISPR/Cas9编辑技术是一种可实用的技术并用于治疗多基因突变引起的肿瘤治疗中。因此，可运用CRISPR/Cas9基因编辑技术用于HCC患者的生物基因治疗。