[发明专利]一种以水溶性苯胺蓝为探针的紫外可见分光光度法测定壳寡糖含量的方法

说明书

本发明涉及一种以水溶性苯胺蓝为探针的紫外可见分光光度法测定壳寡糖含量的方法，属于大分子检测领域。本发明发现壳寡糖在柠檬酸‑盐酸‑氢氧化钠缓冲溶液中与水溶性苯胺蓝缔合，在一定的浓度范围内，其吸光度值随壳寡糖含量的增加而降低，在一定浓度范围内，吸光度的降低值与壳寡糖浓度呈线性关系，以此作为壳寡糖的定量基础，建立了一种壳寡糖的定量分析方法，本方法需考虑实际样品工作曲线是否与标准品的工作曲线是否相近，其具有试剂廉价，灵敏度高，重现性好，操作简便等优点，适合在实际应用中推广使用。

技术领域

本发明涉及一种以水溶性苯胺蓝为探针的紫外可见分光光度法测定壳寡糖 含量的方法，属于大分子检测领域。

背景技术

壳寡糖(COS)是从虾蟹类生物外壳的甲壳素中提取或以壳寡糖为原料经酶 解反应所得到的，是以2-10个乙酰氨基葡萄糖经β-1,4糖苷键连接而成的低分子 量葡萄糖，水溶性好、易被人体吸收且生物活性高。壳寡糖保留了壳寡糖降低血 压、降低胆固醇、治疗烧烫伤、排出体内有毒有害物质、抗氧化、抑菌、抗肿瘤、 增强免疫力、强化肝脏等脏器的功能，引起医药研究者的密切关注。COS作为 饲料添加剂具有益生素的功能，可减少抗生素的使用，改善动物肠道健康，提高 动物生产性能。壳寡糖是目前发现自然界中的唯一一种带正电荷，呈碱性的水溶 性多糖，其来源广泛，安全无毒，在医药、食品、保健品等诸多领域应用广泛。 COS还作为一种新型功能性饲料添加剂，对其的应用研究越来越广泛。2014年 卫计委将壳寡糖列为食品添加剂，以壳寡糖为主要成分的肥料、保健品等不断的 推出，但壳寡糖含量的测定方法还不成熟，因此，一种简便有效测定壳寡糖含量 的新方法具有重要的意义。

目前，壳寡糖含量的检测方法一般采用化学试剂法。化学试剂法的原理是将 高分子寡糖在强酸的条件下分解成单糖N-乙酰氨基葡萄糖，然后通过3,5-二硝 基水杨酸(DNS)测定单糖的含量，从而得出高分子寡糖的含量。该方法检测成 本低，易操作，但检测结果无法确定寡合度在2-10个之间的壳寡糖的含量，灵 敏度低。Elson-Morgan法测定壳寡糖含量回收率低，不适合壳寡糖含量的测定。 苯酚硫酸法^[21]对氨基葡萄糖在200-3000ug范围也有良好的标准曲线，但测定壳 寡糖的含量较实际值偏大，灵敏度低。高效液相色谱法对测定2-6个寡合度壳寡 糖含量有灵敏度高、方法简单、分析速度快、结果准确等优点。而目前国内外， 利用紫外可见分光光度法直接测定壳寡糖含量的相关研究较少，因此，紫外可见分光光度法测定壳寡糖有着很大的研究空间及重要意义。

发明内容

本发明提供一种以水溶性苯胺蓝为探针的紫外可见分光光度法测定壳寡糖 含量的方法。本发明利用壳寡糖在一定条件下能与水溶性苯胺蓝结合形成离子缔 合物，使紫外吸收强度显著降低。通过紫外吸收强度与壳寡糖含量在一定的浓度 范围内呈线性关系，以此作为壳寡糖的定量基础。本方法测定受壳寡糖的分子量 的影响，其具有试剂廉价，灵敏度高重现性好的优点，适合在实际应用中推广使 用。

一种以水溶性苯胺蓝为探针的紫外可见分光光度法测定壳寡糖含量的方法， 其包括下述步骤：

1)绘制壳寡糖(COS)的标准曲线：向10mL比色管中按先后顺序分别加 入一定酸度的柠檬酸-盐酸-氢氧化钠缓冲液2.00mL，水溶性苯胺蓝 (1.0×10^-4mol/L)1.50mL，一定浓度体积成梯度COS标准液(20.00μg/mL)使用 蒸馏水定容后充分摇匀，制备得浓度成梯度的标准溶液，将其置于80℃水浴加 热，反应完毕冷却30min，于紫外分光光度计上，在波长590nm处以水为参比测 量吸光度ABS；其中试剂空白记为A₀，含壳寡糖的溶液记为A，并计算△A＝A–A₀， 建立△A与壳寡糖浓度的标准曲线。

2)40μg/mL的样品工作液的制备：称取一定量待检测样品的胶囊壳，使用 冰醋酸溶解并将其定容得到样品储备液，用漏斗脱脂棉过滤储备液，滤液经 6000r/min，离心机离心20min，取上清液10mL于100mL容量瓶，定容，得浓度为 40μg/mL的样品工作液。