[发明专利]一种glnA基因缺失的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用

说明书

本发明涉及微生物领域，具体公开了一种glnA基因缺失的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。所述glnA基因缺失的耐铵固氮微生物在无铵和有铵条件下都能进行生物固氮，提高了类芽孢杆菌属微生物在高铵条件下的固氮酶活性，突破了高铵条件对生物固氮的抑制作用，在农业生产中具有广泛的应用前景。

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说，涉及一种glnA基因缺失的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

背景技术

氮素是植物生产中必需的最大元素。化学氮肥在保障我国粮食生产、蔬菜种植和果树栽培中起着十分重要的作用。但长期过量偏施化学氮肥，导致土壤酸化和盐渍化，土壤微生物活力下降，己成为农业可持续发展的一个重要制约因子。

生物固氮是少数细菌，在常温常压下将空气中的氮气还原成铵的过程，固氮形成的铵被植物吸收利用。但生物固氮是一个高耗能过程，酶还原1分子氮，需要消耗16个ATP，因此生物固氮受产物铵的严格调控。铵浓度低(0-10mM)时，固氮菌进行生物固氮；铵浓度高(大于10mM)时，固氮菌只生长而不固氮。也就是说，固氮菌在贫瘠的土壤里固氮效率高，在肥沃的土壤里固氮效率低。突破铵的抑制作用，一直是生物固氮研究领域的一个研究热点。获得在高铵条件下固氮的微生物，在农业生产中具有重要的应用价值。

发明内容

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种glnA基因缺失的耐铵固氮微生物及其构建方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

glnA基因几乎存在于所有微生物中。glnA基因的产物谷氨酰胺合成酶,该酶催化谷氨酸和铵合成谷氨酰胺,谷氨酰胺为其它氨基酸的合成提供氨。

本发明首次通过研究发现，在固氮类芽孢杆菌中,有2个glnA基因：1个glnA基因与glnR连接在一起组成glnRA转录单元，另一个glnA基因(这里命名为glnA1基因)单独存在。在高铵条件下，glnA基因(来自glnRA转录单元)的产物谷氨酰胺合成酶帮助GlnR与固氮基因簇上游的启动子区的GlnR-binding site结合，抑制固氮基因的转录，进而抑制固氮酶活性。glnA基因缺失或，解除了对固氮酶活性的抑制作用。

基于前述研究发现，本发明提供了一种glnA基因缺失的耐铵固氮微生物，缺失如SEQ ID NO.1所示的glnA基因。

进一步地，所述微生物为固氮类芽孢杆菌属。

在本发明的具体实施方式中，采用多粘类芽孢杆菌作为代表，以说明本发明构建方法构建得到的突变株。

进一步地，本发明以多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)为例，提供了所述耐铵固氮微生物的构建方法，包括如下步骤：

(1)利用SEQ ID NO.2～3所示的引物up(glnRA)-F/up(glnA)-R扩增glnA上游同源臂(1001bp)，利用SEQ ID NO.4～5所示的引物down(glnA)-F/down(glnA)-R扩增下游同源臂(511bp)；

(2)将载体pRN5101用BamHI/SalI限制性内切酶处理，得到酶切片段；

(3)利用Gibson assembly master mix(New England Biolabs)对步骤(1)所得的上游同源臂、下游同源臂和步骤(2)所得的酶切片段进行组装，组装后的重组质粒转化固氮多粘类芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)；

(4)利用载体质粒pRN5101携带的红霉素抗性筛选单交换菌株，通过多代培养后，再从中筛选不再具有红霉素抗性的菌株，经PCR验证和测序确认得到同源双交换后glnA基因缺失后的突变株。