[发明专利]人源化基因改造动物模型的制备方法及应用

权利要求书

1.一种用于制备CD137基因人源化的靶向载体，其包含：a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其选自CD137基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸；b)插入或替换的供体DNA序列，其编码供体转换区；和c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其选自CD137基因基因组DNA的100-10000个长度的核苷酸，其中所述的待改变的转换区位于Cd137基因第2号外显子至第7号外显子，所述插入或替换的供体DNA序列片段来自人CD137基因第3号外显子至第8号外显子的部分，所述的人CD137基因第3号外显子至第8号外显子的部分如SEQ ID NO：21所示。

2.根据权利要求1所述的用于制备CD137基因人源化的靶向载体，其特征在于，a)与待改变的转换区5’端同源的DNA片段，即5’臂，其序列如NCBI登录号为NC_000070.6的第150924999-150929845位核苷酸所示；c)与待改变的转换区3’端同源的第二个DNA片段，即3’臂，其序列如NCBI登录号为NC_000070.6的第150935815-150940542位核苷酸所示。

3.根据权利要求1或2所述的用于制备CD137基因人源化的靶向载体，其特征在于，所述用于制备CD137基因人源化的靶向载体还包括基因标记，阳性克隆筛选的抗性基因，和/或，特异性重组系统。

4.一种细胞，其特征在于，所述细胞包含权利要求1-3任一所述的用于制备CD137基因人源化的靶向载体。

5.权利要求1-3任一所述的用于制备CD137基因人源化的靶向载体、权利要求4所述的细胞在构建包含CD137基因人源化的非人动物或其子代中的应用。

6.一种制备CD137基因人源化非人动物或其子代的方法，其特征在于，包括导入人CD137基因，使得该人CD137基因在非人动物或其子代细胞中表达并且促进该细胞产生人源化的CD137蛋白，同时降低或消除了非人动物或其子代的体内内源/动物来源的CD137蛋白的表达，所述的方法包括将动物来源的Cd137的第2-7号外显子部分替换为人CD137的第3-8号外显子的部分序列，所述的人CD137的第3-8号外显子的部分序列如SEQ ID NO：21所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用权利要求1-3任一所述的用于制备CD137基因人源化的靶向载体或权利要求4所述的细胞将动物来源的Cd137的第2-7号外显子部分替换为人CD137的第3-8号外显子的部分序列。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(a)使用权利要求1-3任一所述的用于制备CD137基因人源化的靶向载体靶向细胞中的目标基因组以形成经遗传修饰的非人类哺乳动物细胞或提供权利要求4所述的细胞；其中所述非人类哺乳动物细胞为胚胎干细胞；(b)将所述细胞在培养液中进行培养；

(c)将培养后细胞移植至受体雌性非人类哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人类哺乳动物的子宫中发育；

(d)鉴定步骤(c)的怀孕雌性动物的后代基因改造人源化动物中的种系传递。

9.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，使用基因编辑技术进行CD137基因人源化非人动物或其子代的建立，所述基因编辑技术包括基于胚胎干细胞的基因同源重组技术、CRISPR/Cas9、锌指核酸酶技术、转录激活子样效应因子核酸酶技术、归巢核酸内切酶或其他分子生物学技术。

10.根据权利要求6-8任一所述的方法，其特征在于，所述动物是啮齿类动物。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述啮齿类动物为小鼠。

12.根据权利要求6-8和11任一所述的方法，其特征在于，所述动物用作动物模型。