[发明专利]一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法

说明书

本发明涉及一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法，其包括如下步骤：取足月脐带，鉴定符合要求后方可用；将脐带剪成组织段，剥离华通胶，将华通胶剪成块状；采用双酶法消化脐带组织块；过滤收集细胞，使用含有脐血血浆的培养基培养与扩增间充质干细胞；采用饥饿培养法，制备上清液；在上清液中加入保护剂进行保藏。本发明提供的脐带间充质干细胞培养上清液的保藏方法确保在4℃存放15天后，干细胞上清中的蛋白含量无明显变化，延长干细胞培养上清液在4℃的存放时间，降低干细胞培养上清的运输成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞培养 上清液的保藏方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够进行自 我更新、多分化潜能的多能干细胞，可以向神经细胞、心肌细胞、肌 细胞等多种终末组织器官的细胞分化，其在细胞替代治疗、支持造血、 基因治疗等方面有着广泛的应用前景。

脐带是连接胎儿和胎盘的管状结构，有两条动脉和一条静脉。研 究显示，在脐带血管和内壁之间含有疏松的胶状物质(称为华通胶)， 该胶状物质里含有丰富的脐带间充质干细胞。从脐带分离出来的干细 胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大 降低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微 生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任 何危害及损伤。以上原因使得脐带间充质干细胞成为研究的热点。

目前已报道的脐带间充质干细胞分泌成分主要分为3类：1、细 胞外基质类，如各种胶原蛋白和弹性蛋白等，可促进细胞外基质的重 塑；2、生长因子类，如TGF、HGF、VEGF和bFGF等；3、炎症因 子及趋化因子类，如PGE2、IL-6、IL-8等。由于脐带间充质干细胞 能够分泌多种因子，因此，越来越多的研究集中在干细胞的旁分泌作 用，研究表明，干细胞旁分泌作用对皮肤损伤修复，参与机体的免疫 应答反应等方面具有重要的作用。

脐带间充质干细胞分泌的多种因子多为蛋白成分，如何确保干细 胞上清中有效因子的含量，是目前急需解决的问题，也是直接影响干 细胞临床应用的瓶颈之一，目前延长蛋白保存时间的唯一有效的方法 是降低保存温度，常用的是-20℃以下温度保存，这也给蛋白类物质 的运输增加了成本，本发明立足于延长脐带间充质干细胞培养上清液 冷藏时的存放时间，确保干细胞分泌因子的含量，为临床使用干细胞 分泌因子提供可能。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种脐带间充质干细胞培 养上清液的保藏方法。

本发明第一方面提出一种脐带间充质干细胞培养上清液的保藏 方法，包括如下步骤：

(1)取足月健康胎儿脐带，用胶体金、荧光定量PCR相结合的 方法检测脐带血清HbsAg，抗-HCV，HCV-RNA，抗-HDV，抗HEV， 抗-HIV-1/2，HIV-1-RNA，CMV-DNA，检测结果均为阴性的脐带方 可使用；

(2)将脐带剪开，平铺，用PBS缓冲液清洗脐带组织至无血色；

(3)将步骤(2)获得的脐带组织剪成组织段，然后剥离所述组 织段的华通胶，并将华通胶置于洁净的器皿中，用手术剪剪成块状；

(4)在步骤(3)获得的块状组织中，先后加入0.1％II型胶原 酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心， 去掉上清液；

(5)使用含有脐血血浆的培养基重悬步骤(4)获得的细胞沉淀， 放入纤维连结蛋白包被的培养瓶中，加入足量的含有脐血血浆的培养 基，置于CO2培养箱内培养；

(6)在培养后的4～5天进行第一次换液，以后3～4天 换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化 后传代；