[发明专利]获得高阳性率CAR-T细胞的方法

说明书

本发明涉及获得高阳性率CAR‑T细胞的方法，该方法包括使用CD28抗体和该CAR‑T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原孵育所述CAR‑T细胞的步骤。采用本发明的方法，初始可获得中等阳性比例的CAR‑T细胞，有助于其增殖，而且由于对特异性抗原的记忆，群体中的CAR‑T细胞比例会越来越高，最终获得大量高阳性率的CAR‑T细胞。

技术领域

本发明涉及获得高阳性率CAR-T细胞的方法。

背景技术

癌症现在已成为人类健康的头号杀手，快速的生活节奏、巨大的工作压力、不健康的饮食习惯、糟糕的环境都是癌症发生的帮凶，使得癌症的高发率和年轻化趋势也越来越明显。目前常用的治疗手段效果十分有限，仍需探索一个更加有效的治疗方法，来提高癌症患者的生存率和生存质量。

针对恶性肿瘤的免疫治疗近年来发展迅速，取得了令人瞩目的临床疗效。自2011年，Nature及临床肿瘤最顶级杂志JCO分别发表相同题目“肿瘤免疫治疗的时代已经来临”的评论文章(Nature.2011；480(7378):480；J ClinOncol.2011；29(36):4828)，肿瘤免疫细胞治疗迎来新一轮的研究热潮。

嵌合抗原受体T细胞疗法作为肿瘤免疫治疗的重要分支之一，在恶性血液肿瘤中已经取得了非常好的疗效，对复发难治性B细胞白血病的完全缓解率超过90％。2017年8月，美国FDA批准了诺华的tisagenlecleucel嵌合抗原受体T细胞(CAR-T细胞)治疗用于治疗儿童和年轻成年患者急性淋巴细胞性白血病(ALL)，成为第一个批准上市的CAR-T药物。紧接着同年10月，美国FDA又宣布批准了Kite Pharma的CAR-T疗法Yescarta上市，治疗罹患特定类型的大B细胞淋巴瘤成人患者。CAR-T药物的陆续获批使得CAR-T治疗迈上了一个新的台阶。

嵌合抗原受体是一种人工合成受体，它通常包含胞外抗原结合域、跨膜铰链区和胞内信号转导区。通过将识别肿瘤相关抗原(tumor associated antigen,TAA)的抗体单链可变区(single-chain fragment variable，scFv)和胞内信号域“免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motifs，ITAM)”在体外进行基因重组。再通过病毒或其它载体系统将其导入T细胞中，这样经过基因改造的T细胞称之为嵌合型抗原受体T细胞(即CAR-T细胞)。CAR-T细胞在体外经大规模扩增后，回输到患者体内，能够以非MHC限制性的模式表现强效的抗癌作用。

但是，目前CAR-T细胞治疗总体疗效仍不尽如人意，尤其是针对实体瘤。其中转染效率低，难以获得高阳性率的CAR-T细胞是一个很重要的原因。对于PBMC的转染来说，无论是病毒载体还是PB转座酶等非病毒载体，其转染效率都很难突破50％，通常只能达到20％左右。一般必须通过准备大量的细胞才能保证足够量的CAR-T阳性细胞。

为了提高CAR-T的阳性率，科研人员经过了大量的实验摸索。通常情况下，T细胞转染CAR基因后会通过CD3/CD28抗体包被或者CD3/CD28抗体磁珠刺激T细胞活化，但是这种刺激方法对于T细胞是广谱性的，无论是否转染进CAR基因，都会被活化。由于竞争生长，CAR-T细胞比例可能会被不断稀释，最终获得的T细胞群体中，CAR-T比例很低。

为了解决这一问题，有人尝试用特异性抗原来活化转染CAR基因后的T细胞，该方法是用特异性抗原与scFv的结合作为T细胞活化的第一信号，并将信号转导至CAR-T细胞胞内共刺激区，激活第二信号来活化T细胞，这样虽然能获得很高阳性比例的CAR-T细胞，但是其增殖很慢，很难获得大量的目的细胞。原因可能是由于T细胞集群效应，T细胞增殖旺盛时通常会聚集成团，细胞相互之间会分泌一些细胞因子来促进增殖，由于转染效率不高，导致初始的CAR-T细胞量不够，增殖很慢。

发明内容

本发明提供一种制备CAR-T细胞的方法，所述方法包括使用CD28抗体和该CAR-T细胞所表达的嵌合抗原受体靶向的抗原孵育所述CAR-T细胞的步骤。