[发明专利]稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途

说明书

本发明涉及特异性靶向Muc1抗原且高水平稳定表达PD‑1抗体的CAR‑T细胞及用途。具体而言，本发明的T细胞含有表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体的编码序列和PD‑1抗体的编码序列；和/或表达识别Muc1抗原的嵌合抗原受体和PD‑1抗体。本发明提供的嵌合抗原受体从N端到C端依次含有膜蛋白信号肽、抗Muc1近膜端的单链抗体、长50个氨基酸残基以上的铰链区、跨膜区、共刺激信号分子胞内结构域和免疫受体酪氨酸活化基序。本发明的T细胞能克服免疫微环境抑制，促进肿瘤细胞的凋亡，发挥抗肿瘤的免疫反应，本发明提供的T细胞可以用于多种Muc1阳性恶性肿瘤的治疗。

技术领域

本发明涉及稳定表达PD-1抗体的Muc1特异性CAR-T细胞及其用途。

背景技术

嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cell，CAR-T)治疗技术无疑是肿瘤免疫细胞治疗领域中一颗冉冉升起的巨星。CAR-T技术是通过基因工程技术将识别某抗原分子的抗体可变区基因序列与T淋巴细胞免疫受体的胞内区序列拼接后，通过逆转录病毒或慢病毒载体、转座子或转座酶系统或直接mRNA转导到淋巴细胞内，并表达融合蛋白于细胞表面，使T淋巴细胞能通过非MHC限制性的方式识别特定抗原，增强其识别和杀伤肿瘤的能力。

CAR的结构自1989年以色列Eshhar研究小组首次提出后，经过近30年的发展，已经被证实经过CAR结构修饰的T细胞在肿瘤免疫治疗中具有较好的疗效。第一代CAR受体包含了胞外特异识别肿瘤抗原的片段(single-chain variable fragment，scFv)，胞内激活信号由CD3ζ信号链来传递。但是第一代CAR受体缺乏T细胞的共刺激信号，导致T细胞只能发挥瞬间效应，在体内存在时间短、细胞因子分泌少。第二代CAR受体增加了共刺激信号分子的胞内结构域，包括如CD28，CD134/OX40，CD137/4-1BB，淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)，可诱导的T细胞共刺激剂(ICOS)以及DNAX活化蛋白10(DAP10)等结构域，增强了T细胞的增殖能力及细胞因子的分泌功能，IL-2、IFN-γ以及GM-CSF增加，从而突破肿瘤微环境的免疫抑制、延长AICD(激活诱导的细胞死亡，AICD)。第三代CAR受体则是在共刺激结构CD28和ITAM信号链之间再融合一个二级共刺激分子如4-1BB，因而产生了一个三重信号的CAR受体，第三代CAR受体改造的T细胞具有更好的效应功能和体内存活时间。常用的经典CAR-T结构即为二代CAR受体，其结构具体可分为以下4部分：识别肿瘤抗原的抗体单链可变区(scFv)、铰链区、跨膜区、胞内刺激信号结构区域。其中，CAR结构铰链区负责形成正确构象，形成二聚体。铰链区的长短及氨基酸序列特征决定了CAR的空间构象，也决定了其与肿瘤细胞表面抗原结合的能力。

实体瘤具有高度的异质性，不同患者、同一患者不同病灶、同一病灶不同肿瘤细胞之间均存在高度的差异。这种高度的异质性致使肿瘤靶向治疗缺乏理想的通用、广谱靶点，限制了CAR-T细胞治疗实体瘤的疗效。因而，寻找有效的CAR-T细胞治疗靶点已然成为CAR-T细胞治疗的重中之重。Muc1(mucins，粘蛋白)是一类高分子量(200kD)的Ⅰ型跨膜糖蛋白(多以O-糖苷键与多肽骨架上的Ser/Thr相连)，正常情况下主要表达于多种组织、器官中上皮细胞近管腔或腺腔面，呈顶端表达，极性分布。在肿瘤发生时，Muc1蛋白可在肿瘤细胞表面异常表达，表达量可达正常时的100倍以上。并且，其在细胞表面的极性分布丧失，可在整个细胞表面均匀分布。另外，由于糖基化不全，Muc1蛋白的结构也发生改变，出现新的糖链及肽表位。出现的这些新的糖链和肽表位虽然可以成为CAR-T细胞治疗很理想的靶点，但由于在不同的肿瘤细胞表面会展示出不同的糖链和肽表位，特异性靶向某种糖肽的CAR-T细胞也许不能在多种类型的肿瘤中得到应用。