[发明专利]基于光切割基序的蛋白纯化方法

说明书

本发明涉及一种基于光切割基序对目的肽进行纯化的方法。具体而言，本发明的蛋白纯化方法通过光切割基序将功能片段与目的肽相连，利用功能片段进行纯化，随后通过使用365‑450nm的光照射使得光切割基序光解，将所述目的肽与所述功能片段分离，从而获得目的肽。该纯化方法适用于对多种表达系统表达的蛋白(特别是分子量低的小肽)进行纯化，具有成本低、流程简单、易于工业化实现等优点，可用于实验室规模的蛋白纯化，也有利于工业化规模的低成本蛋白生产。

技术领域

本发明涉及一种基于光切割基序对目的肽进行纯化的方法。具体而言，本发明通过光切割基序将功能片段与目的肽相连，利用功能片段进行纯化，随后通过使用特定波长的光照射使得光切割基序处发生断裂(光解)，从而获得目的肽。

背景技术

无论是实验室规模还是工业生产领域，蛋白纯化都是基因工程和蛋白质工程中的关键环节。据统计，基因工程产品的分离纯化成本约占到其全部成本的60％～80％(陈浩、陈玉红、朱德煦、刘建宁，重组蛋白纯化技术，中国生物工程杂志，2002，22(5)：87-92)。已经开发出高效的原核、真菌和真核细胞类蛋白表达体系，然而，不论通过何种体系表达，目的肽都可能与组织和细胞中的其它蛋白相互作用形成复杂的混合物，造成分离纯化十分困难。

目前使用的纯化方法主要包括层析(例如离子交换层析、疏水性相互作用层析、亲和层析等)和电泳技术。然而，就层析技术而言，离子交换层析和疏水性相互作用层析对初始样品的理化性质有一定的要求，通用性和纯化效率不高；亲和层析需要使用带有不同特异性标签的凝胶树脂，并且在纯化后需要添加蛋白酶去除特殊的标签氨基酸序列，纯化成本高昂。另一方面，对于电泳技术，其分离精度和纯化效率也难以满足现有的需求。因此，这两种方法均不利于大规模工业领域生产与应用。总体来说，蛋白纯化技术在效率和成本方面仍有待提高。

最近提出了利用自组装短肽对蛋白进行纯化的方法。这类短肽的氨基酸序列具有能够借助氢键、静电相互作用或亲疏水相互作用而形成聚集体的特征。例如，用于对蛋白进行纯化的自组装短肽的氨基酸序列可具有交替出现的正负电荷(例如-+-+-+-+，--++--++，----++++)，由于静电相互作用形成稳定的β折叠而发生聚集，最终形成脚手架式的水凝胶，因此易于通过离心等方式分离。此类短肽在组织工程、药物递送和生物膜工程中可发挥重要作用。然而，在这样的方法中，仍缺少对自组装过程进行有效控制的手段。此外，现有方法大多通过蛋白酶消化或化学切割的方式去除短肽，因此对目的肽的序列特征有一定的要求。

最近发展的光遗传学技术通过在体内表达能够响应于光刺激而发生肽键断裂的荧光蛋白，实现对功能蛋白定位的调控或蛋白纯化。例如，Floyd,N.等，2009，Photoinduced,family-specific,site-selective cleavage of TIM-barrel proteins.JAm Chem Soc 131，12518-12519公开了将响应于UV光而断裂GH-1片段与亲和层析标签(例如六聚组氨酸标签)相连，从而避免了洗脱中由于缓冲液pH的改变或蛋白变性剂的加入而导致的折叠错误。然而，在该方法中，为了使得肽键断裂，UV光的照射时间长达数小时；此外，仍需要变性和重新折叠才能释放GH-1片段。因此，本领域仍需开发新的用于蛋白纯化的光切割基序。

发明内容

本发明提供了一种蛋白纯化方法，所述方法包含如下步骤：

a)在宿主细胞中表达融合蛋白，所述融合蛋白包含目的肽、用于纯化的功能片段以及连接所述目的肽和所述功能片段的光切割基序；

b)使得所述融合蛋白与所述宿主细胞分离；

c)利用365-450nm波长的光对所述融合蛋白照射30-100min；以及

d)将所述目的肽从所述片段混合物中分离，从而获得纯化的所述目的肽。

有益效果