[发明专利]一种清宫寿桃丸的药效物质基础研究方法

权利要求书

1.一种清宫寿桃丸的药效物质基础研究方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)针对清宫寿桃丸进行LC-MSⁿ整体分析，对其中主要的化学成分进行结构鉴定，确定其中的系列成分种类；

(2)分别建立系列成分的LC-MS分析方法，进行快速的结构鉴定；

所述LC-MS分析方法中样品溶液的制备包括如下步骤：

(1)制剂供试品溶液的制备：取清宫寿桃丸粗粉0.3g置于50mL锥形瓶中，加甲醇25mL，称重，室温超声处理30min，静置冷却至室温，再次称重，加甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

(2)各药味供试品溶液的制备：取清宫寿桃丸各药味，粉碎，过四号筛，称取0.8g置于50mL锥形瓶中，加甲醇10mL，称重，室温超声处理30min，静置冷却至室温，再次称重，加甲醇补足减失的重量，过0.22μm微孔滤膜，取续滤液，即得；

(3)标准品溶液的制备：分别取绿原酸、新绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、松果菊苷、芦丁、槲皮苷、异槲皮苷、类叶升麻苷、3,4-二咖啡酰奎尼酸、3,5-二咖啡酰奎尼酸、三七皂苷R1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rh1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rd、酸枣仁皂苷B、人参皂苷Rg3、1,5-二咖啡酰奎尼酸和阿魏酸适量，加甲醇制成每1mL含各对照品约50μg的溶液，于4℃条件下密封避光保存，即得；

鉴定大鼠血浆和尿液中的代谢成分样品处理方法包括甲醇沉淀法、乙腈沉淀法以及SPE固相萃取小柱方法；

所述甲醇沉淀法步骤如下：

血样的处理方法：将各组冻存的血液样本放到室温下解冻，取不同组别含药血清及空白血清各200μL，分别加入600μL甲醇，涡旋振荡3min，离心30min，静置后取上清液，在室温下用N2吹干，残渣用100μL的初始流动相复溶，涡旋震荡3min后，14000rpm离心15min，取上清液进UPLC-LTQ-Orbitrap分析；

尿样的处理方法：将各组冻存的尿液样本放到室温下解冻，取含药尿样及空白尿样各200μL，分别加入600μL甲醇，涡旋振荡3min，离心30min，静置后取上清液，在室温下用N₂吹干，残渣用100μL的初始流动相复溶，涡旋震荡3min后，14000rpm离心15min，取上清液进UPLC-LTQ-Orbitrap分析；

所述乙腈沉淀法步骤如下：

血样的处理方法：将各组冻存的血液样本放到室温下解冻，取不同组别含药血清及空白血清各200μL，分别加入600μL乙腈，涡旋振荡3min，离心30min，静置后取上清液，在室温下用N2吹干，残渣用100μL的初始流动相复溶，涡旋震荡3min后，14000rpm离心15min，取上清液进UPLC-LTQ-Orbitrap分析；

尿样的处理方法：将各组冻存的尿液样本放到室温下解冻，取含药尿样及空白尿样各200μL，分别加入600μL乙腈，涡旋振荡3min，离心30min，静置后取上清液，在室温下用N2吹干，残渣用100μL的初始流动相复溶，涡旋震荡3min后，14000rpm离心15min，取上清液进UPLC-LTQ-Orbitrap分析；

所述SPE固相萃取小柱方法步骤如下：

血样的处理方法：取GracePureTMSPE固相萃取小柱，先用5mL的甲醇活化小柱，后加入5mL的去离子水平衡固相萃取小柱；将1mL的血浆样品置于已活化的固相萃取小柱，然后用2mL水冲洗杂质，随后用3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；将所有上述甲醇洗脱液，在室温下用N2吹干，残渣用100μL的初始流动相复溶，涡旋震荡3min后，14000rpm离心15min，取上清液进UPLC-LTQ-Orbitrap分析；

尿样的处理方法：将各组冻存的尿液样本放到室温下溶解，取2mL的尿液置于已活化的固相萃取小柱，然后用3mL水冲洗杂质，随后用3mL甲醇洗脱，收集甲醇洗脱液；将所有上述甲醇洗脱液，在室温下用N2吹干，残渣用100μL的初始流动相复溶，涡旋震荡3min后，14000rpm离心15min，取上清液进UPLC-LTQ-Orbitrap分析；

所述LC-MS分析方法中UPLC条件如下：

以WatersACQUITYUPLCHSST3，2.1×100mm，1.8μm为色谱柱；以0.1％甲酸为流动相A，以乙腈为流动相B，梯度洗脱，洗脱梯度为：0-2min，8％B；2-20min，8-26％B，20-22min，26％B；22-30min，26-42％B；30-50min，42-60％B；50-55min，60-95％B；55-58min，95％B，58-60min，95-8％B；60-65min，8％B；室温；进样量为3μL，流速为0.3mL/min；

所述LC-MS分析方法中MS条件如下：

负离子模式，毛细管温度350℃，鞘气流速30arb，辅助气流速10arb，喷雾电压：3kV，毛细管电压：-35V，管透镜电压：-110V；

高分辨质谱质量轴准确度采用咖啡因、十二烷基硫酸钠、牛磺胆酸钠、tetrapeptideMRFA和Ultramark混合标准品溶液进行校正，质量精度误差在5ppm以内；

质量检测范围：m/z100-1200；样品采用全扫描的方式扫描，以高分辨FT进行全扫描，分辨率R设为30000，以离子阱打拿极检测碎片离子；

设置动态排除，重复次数：3，重复时间：10s，排除清单大小：100，排除时间：20s。