[发明专利]一种固相聚合蛋白质的方法

说明书

本发明提出一种固相聚合蛋白质的方法，聚合度高，分子量分布较窄，聚合蛋白混合物中几乎不含有未聚合的蛋白质。该方法包括以下步骤：首先将固相吸附介质与蛋白质混合，所述固相吸附介质为阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；待蛋白质被吸附于固相吸附介质上后，洗涤去除未吸附于固相吸附介质上的蛋白质，然后加入多醛基分子与蛋白质进行交联，再加入蛋白质进行聚合；聚合完成后，加入还原剂将希夫氏碱的双键还原成稳定的单键，洗涤去除其他反应物，得到聚合蛋白混合物。

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种聚合蛋白质的方法。

背景技术

蛋白质通过聚合或者修饰手段增大其分子量或分子半径后，在保留其原有一些生物特性之外也可形成新的性质，如胶体渗透压降低、半衰期增长等，可应用于生物医药领域。

目前蛋白质聚合使其分子量增大主要应用于血红蛋白氧载体领域，通过多醛基分子将蛋白质表面的氨基通过希夫氏碱反应将蛋白质交联起来增大其分子量。聚合方法通常是在蛋白质溶液中直接加入戊多醛、氧化棉子糖等多醛基分子使蛋白质聚合，最终形成由未聚合蛋白质和不同聚合度的蛋白质混合的一种蛋白质混合物，由于这种方法中仍有大量未聚合的蛋白质，一般需要在聚合过程完成后再用其它的方法予以去除。去除过程较为繁琐，时间较长。

另外一种聚合蛋白质的方法是将将蛋白质吸附在阴离子交联树脂上，然后装填在层析柱上，加入戊多醛使蛋白质交联，用还原剂将希夫氏碱还原后，将聚合的蛋白质洗脱下来，该方法聚合的混合物中仍含有大量的未聚合的蛋白质，仍需要后续的纯化步骤将未聚合的蛋白质去除。

发明内容

为了克服上述方法的缺点，本发明提出一种固相聚合蛋白质的方法，聚合度高，分子量分布较窄，聚合蛋白混合物中几乎不含有未聚合的蛋白质。

本发明的方案如下：

该固相聚合蛋白质的方法，包括以下步骤：首先将固相吸附介质与蛋白质混合，所述固相吸附介质为阴离子交换树脂或阳离子交换树脂；待蛋白质被吸附于固相吸附介质上后，洗涤去除未吸附于固相吸附介质上的蛋白质，然后加入多醛基分子与蛋白质进行交联，再加入蛋白质进行聚合；聚合完成后，加入还原剂将希夫氏碱的双键还原成稳定的单键，洗涤去除其他反应物，得到聚合蛋白混合物。

基于以上方案，本发明进一步对各个具体步骤作了如下优化：

在固相吸附介质与蛋白质混合前，先进行：

步骤1)固相吸附介质的预处理：在固相吸附介质加入所述多醛基分子(该环节采用的“多醛基分子”与后面的聚合反应环节加入的“多醛基分子”为同一物质)，多醛基分子与固相吸附介质上可能的与醛基能够起反应的基团进行反应，然后加入所述还原剂(该环节采用的“还原剂”与后面的聚合反应环节加入的“还原剂”为同一物质)继续反应，对还原生成的产物以及多余的多醛基分子离心并弃掉上清，用缓冲液重复洗涤至干净；

步骤2)多醛基分子溶液的预处理：将多醛基分子溶液与多醇羟基分子溶液按照摩尔比1:40-1:100的比例进行混合，加入酸进行催化，使溶液pH为4-7，反应温度为0—40℃。

上述步骤1)中，加入的多醛基分子的浓度为0.01M-0.5M；固相吸附介质与多醛基分子溶液的体积比为1:2-1:30，还原剂加入的量为多醛基分子溶液体积的1.5倍至50倍；反应0.5小时以上；

上述步骤2)中，加入的酸为硫酸、盐酸或磷酸，反应时间为40min以上。

上述多醛分子可以是戊二醛、丙二醛等；多醇羟基分子可以是乙二醇、丙三醇等。

上述固相吸附介质与蛋白质混合进行吸附以及后续的聚合过程具体为：