[发明专利]一种牙菌斑生物膜模型的培养方法和优化的生物膜活菌计数法及应用

权利要求书

1.一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

S101、在无氧气氛及恒温的环境中，分别对各种口腔致病菌在TSA补加培养基平板上划线培养2～6天至平板上出现大量菌苔；

S102、将经步骤S101培养后的各种口腔致病菌分别接种到BHI富集培养基，在无氧气氛及恒温的环境中分别培养1～3天至BHI富集培养基浑浊，得到各种口腔致病菌的成熟菌悬液；

S103、将步骤S102所得的各种成熟菌悬液添加到含附着力促进剂的BHI富集培养基中，每一种成熟菌悬液的体积百分比为2％～8％；然后在无氧气氛及恒温的环境中接种到成膜介质的孔中，培养14～18小时，在成膜介质的孔底上形成牙菌斑生物膜模型；

所述TSA补加培养基是指每升TSA培养基中含有5克酵母提取物、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；

所述BHI富集培养基是指每升BHI培养基中含有1克蔗糖、1克葡萄糖、1克D-甘露糖、0.5克L-半胱氨酸氨酸盐酸盐、5毫克氯化血红素和1毫克维生素K1的培养基；

所述附着力促进剂为碳酸钙悬浊液，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.1％～0.5％。

2.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，含附着力促进剂的BHI富集培养基中碳酸钙的质量百分比为0.2％。

3.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述口腔致病菌包含血链球菌、变异链球菌、粘性放线菌、鼠李糖乳杆菌、牙龈卟啉单胞菌和具核梭杆菌。

4.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述无氧气氛是指由体积比为80％氮气、10％氢气和10％二氧化碳构成的气体环境。

5.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于，所述恒温的温度为36℃。

6.根据权利要求1所述一种牙菌斑生物膜模型的培养方法，其特征在于：所述成膜介质为TC处理细胞培养板。

7.一种优化的生物膜活菌计数法，其特征在于，所述生物膜为权利要求1所述的牙菌斑生物膜模型，所述优化的生物膜活菌计数法包括以下步骤：

S201消化分散：牙菌斑生物膜模型使用TC处理的24孔细胞培养板培养形成时，向牙菌斑生物膜模型的孔中加入100～200μL质量百分比为0.25％的胰酶溶液，常温消化5min后再沿孔壁向孔中加入如权利要求1所述的BHI富集培养基至总体积为1mL，接着将生物膜吹打混匀重悬形成生物膜菌悬液后转移至无菌离心管中；

S202超声分散：将装有生物膜菌悬液的离心管置于超声波清洗仪中并在25℃下超声6min；

S203计数：用活菌计数法测定生物膜菌悬液的细菌数目，即为牙菌斑生物膜中的活菌数目。

8.一种快速评价口腔护理产品抗菌功效的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S301、沿权利要求1所述的牙菌斑生物膜模型的孔壁加入0.2～1mL的口腔护理产品的样品溶液，保留30秒～3分钟，然后吸取样品溶液并弃去；

S302、沿牙菌斑生物膜模型的孔壁加入与样品溶液等体积的如权利要求1所述的BHI富集培养基，然后马上吸取孔中的BHI富集培养基并弃去；

S303、重复步骤S302两次；

S304、用权利要求7所述的优化的生物膜活菌计数法测定经步骤S303处理的牙菌斑生物膜模型孔中的细菌数目，为经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为N_S；

S305、在权利要求1所述且未经口腔护理产品样品溶液处理的牙菌斑生物膜模型孔中重复步骤S302和S303，然后用权利要求7所述的优化的生物膜活菌计数法测定该孔中的细菌数目，为没有经过口腔护理产品处理的生物膜的活菌数目，记为N_C；

S306、口腔护理产品对牙菌斑生物膜模型的相对杀菌率为或LgNc-LgNs。