[发明专利]一种生物源杀虫剂

权利要求书

1.一种生物源杀虫剂，其特征在于，所述生物源杀虫剂包含至少一种microRNA成分。

2.根据权利要求1所述杀虫剂，其特征在于，所述生物源杀虫剂的制备方法为：获得第一microRNA的前体序列、第二microRNA的前体序列，分别在前体序列发夹结构两端约50bp处设计引物，接着以DNA为模板利用所设引物扩增获得第一microRNA的前体序列的多核苷酸序列、第二microRNA的前体序列的多核苷酸序列，PCR反应体系为50μl，依次加入DNA模板1μl、10×PCRbuffer 5μl、10mM dNTPs 4μl、10μM正向引物0.8μl、10μM反向引物0.8μl、TaKaRa Taq聚合酶0.5μl，最后加ddH2O补至50μl，PCR反应条件为预变性94℃5min，变性94℃30s，退火59℃30s，延伸72℃30s，30个循环，最后延伸72℃10min，4℃保存；

扩增后将所述第一microRNA的前体序列、第二microRNA的前体序列用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，将回收的所述第一microRNA的前体序列、第二microRNA的前体序列的DNA产物分别与pMD19-T载体进行连接反应，连接体系10μl，分别加入0.5μl pMD19-T载体、4.5μl纯化的所述第一microRNA的前体序列、第二microRNA的前体序列的DNA产物、5μlSolution I，16℃下连接3h后将连接产物转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过Amp筛选，挑取阳性克隆，经PCR反应验证及测序鉴定正确后，选取正确的菌液提取连接正确产物的质粒；

将所述质粒分别和DNA双元质粒载体pCAMBIA2301同时用TakaRa公司生产的KpnI和PstI进行双酶切，酶切体系50μl，包括5μl 10×M buffer、28μl质粒、1μl KpnI、1μl PstI和15μl ddH2O，37℃水浴过夜，将DNA双元质粒载体pCAMBIA2301和克隆质粒酶切后，割胶回收DNA片段，接着用T4连接酶连接，然后将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，进行菌液PCR，并提取质粒进行酶切鉴定；

将验证正确的植物表达载体导入农杆菌感受态细胞中并用所述农杆菌感受态细胞将所述植物表达载体转化入植物，最终获得转入第一microRNA的前体序列、第二microRNA的前体序列的植物株系；

大量种植所述转入第一microRNA的前体序列、第二microRNA的前体序列的植物，切碎后用搅拌机搅碎，将搅拌后的植物放置于浓度为75％的酒精中，搅拌均匀，获得生物源杀虫剂。

3.根据权利要求2所述杀虫剂，其特征在于，所述第一microRNA为tca-mir-34、所述第二microRNA为tca-mir-92a。

4.根据权利要求1-3任一所述杀虫剂，其特征在于，所述植物选自水稻、拟南芥、玉米、谷子、小麦或青稞。