[发明专利]一种枯草芽孢杆菌及其培养方法

说明书

本发明公开了一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)KN‑104菌株，该菌株保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017697。通过定向靶标筛选，得到的枯草芽孢杆菌抗病种的特异性强，对水稻稻瘟病、叶瘟病、水稻纹枯病、白菜黑斑病有显著的生防效果，但对番茄灰霉病、西瓜枯萎病、苹果炭疽病、大豆根腐病、番茄叶霉病等病害没有防效，同时该菌株的繁殖能力强且没有溶血性。

技术领域

本发明涉及生物农药及肥料技术领域，特别是枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的筛选及应用。

背景技术

目前防治农作物病害的主要手段为种植抗病品种、施用化学农药以及使用生物农药。而主要的化学农药如三环唑、稻瘟灵乳油、多菌灵、甲基托布津、百菌清等易使病菌产生抗药性，使防效不断下降，使用不当还会给生态环境、人类健康带来不可忽视的严重危害，因此生物防治逐渐成为针对作物病害的主要手段。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种，由于枯草芽胞杆菌具有繁殖快、定植能力强、对人畜无害，环境兼容性好，能够抑制多种植物病害、不易使农作物产生抗药性等优点，是目前应用最为广泛的生防菌之一。但是目前大多数枯草芽孢杆菌因为具有溶血性，而不能应用于生物肥料领域。CN 101121924A公开了一种枯草芽孢杆菌可用于防治由小麦赤霉病、水稻稻瘟病、玉米小斑病、黄瓜炭疽病等引起的农作物、蔬菜等病害。CN 102433282A公开的枯草芽孢杆菌对立枯丝核菌、香蕉炭疽病、稻瘟病、小麦赤霉病、香蕉枯萎病、甘蔗黑腐病、番茄叶霉病等均有强烈的抑制作用，以上均为广谱拮抗菌。

另外，现有的枯草芽孢杆菌发酵水平一直处于瓶颈期，没有很大的突破。邹高溪等(浙江农业学报，2017,29(5):799-805)通过响应面优化，芽孢产量才达到164亿CFU/ml。贾钧辉等(山东农业大学学报(自然科学版),2013,44(1):35-39)对生防枯草芽孢杆菌B579补料分批发酵工艺进行了优化，培养至40h芽孢浓度也才达到280亿CFU/ml。

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术存在的缺点，提供一种抗病害特异性好、繁殖能力强且没有溶血性的枯草芽孢杆菌菌株，本发明还提供该菌株的培养方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

通过定向靶标筛选方法，以水稻稻瘟病为病源靶标，从水稻实验基地的根际土壤中分离得到了一株高效防治病害的细菌，经鉴定属于典型的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，申请人将其命名为枯草芽孢杆菌KN-104。该菌株已于2017年11月17日保藏在位于湖北省武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2017697。

实验结果表明，枯草芽孢杆菌KN-104对水稻稻瘟病、水稻叶瘟病、水稻纹枯病、白菜黑斑病具有较强的抑制能力，但对番茄灰霉病、西瓜枯萎病、苹果炭疽病、大豆根腐病、番茄叶霉病等其它所有作物病害的防效很低或没有防效，从而证明本发明筛选的枯草芽孢杆菌KN-104在防病害种类上具有较强的特异性，能更有针对性的防治作物病害。

本发明所提供的菌株与现有的枯草芽孢杆菌相比，还具有繁殖能力更强的优点，从而能在菌株的培养中获得更高的活芽胞数，有利于降低生产成本，提高生产效率。

大多数微生物在生长代谢过程中会产生溶血素，溶血素会使红细胞完全溶解，从而对人畜产生危害，而本发明提供的枯草芽孢杆菌KN-104完全没有溶血性，因此应用更加安全。

本发明提供的枯草芽孢杆菌KN-104菌株的培养方法，包括以下步骤：

(1)菌种活化：

挑取一环枯草芽胞杆菌KN-104菌株，接种于斜面培养基上，于30℃培养60h，

斜面培养基：蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、氯化钠10g/L、琼脂粉15g/L，pH值7.0；