[发明专利]一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取和建库方法

权利要求书

1.一种用于痰液微生物宏基因组去宿主化提取的工作液，其特征在于，包括第一次痰液液化工作液和第二次痰液液化工作液；

所述第一次痰液液化工作液由胰蛋白酶干粉和TB1 buffer配制而成，其中胰蛋白酶干粉的浓度为5g/L；所述胰蛋白酶干粉的酶活力为1：2500；所述TB1 buffer包含如下终浓度的各组分：50mM CaCl₂、137mM NaCl、2.7mMKCl、10mM Na₂HPO₄•12H₂O和2mM KH₂PO₄，pH值为7.5～8.5；

所述第二次痰液液化工作液由TB2 buffer组成，其包含如下终浓度的各组分：10mMTris-HCl、15mM EDTA、1% Triton X-100、0.25%（w/v）SDS、50mM DTT和20mM HEPS-KOH，pH值为8.0。

2.一种痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，其特征在于，包括以下步骤：第一次痰液液化、第二次痰液液化、微生物破壁、DNA提取和核酸质量检测；

所述第一次痰液液化为取痰液样品，加入1.5倍体积权利要求1中所述的第一次痰液液化工作液，混匀后37℃ 孵育15～30 min，每5min摇晃一次；当痰液变清亮时，即停止反应；

所述第二次痰液液化为向第一次痰液液化后的反应液中加入1.5倍体积权利要求1中所述的第二次痰液液化工作液，混匀后室温孵育10 min，离心后弃去上清液，向沉淀中再加入3～6mL 权利要求1中所述的第二次痰液液化工作液，离心后保留微生物沉淀。

3.根据权利要求2所述痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，其特征在于，所述微生物破壁为溶菌酶破壁或高温破壁。

4.根据权利要求3所述痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法，其特征在于，所述高温破壁条件为95℃水浴孵育5min。

5.一种痰液微生物宏基因组建库方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.按照权利要求2～4中任一所述痰液微生物宏基因组去宿主化提取方法提取痰液样品的基因组DNA；

S2.向S1所得样品基因组DNA中加入转座酶混合液，于50～60℃孵育3～7min，将基因组片段化为230bp长度；

S3.将S2所得产物进行PCR扩增，PCR扩增条件为72℃ 3min；95℃ 30s；95℃ 10s，55℃30s，72℃ 30s，10～14个循环；72℃ 5min；

S4.将磁珠与S3所得产物按体积比为0.5～1：1混合，经清洗、洗脱后回收磁珠上的DNA；

S5.将磁珠与S4所得产物按体积比为0.5～1：1混合，留取上清液，去除DNA大片段；将磁珠与上清液按体积比为0.5～1：1混合，回收磁珠上的DNA；

S6.将纯化后的基因组DNA文库上机检测。

6.根据权利要求5所述痰液微生物宏基因组建库方法，其特征在于，S4中所述磁珠与S3所得产物的体积比为0.8：1；S5中所述磁珠与S4所得产物的体积比为0.65：1，所述磁珠与上清液的体积比为0.8：1。