[发明专利]一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法

说明书

本发明公开了一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法。包括将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体，拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其特征在于，所述的将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体是将hPSCs消化成单细胞，然后收集细胞加入到培养容器中，细胞重聚形成拟胚体。本发明能使视网膜组织的诱导分化以及获取成为流水线操作，可实现工厂化生产，以供大规模临床应用或药物筛选使用。

技术领域：

本发明属于干细胞诱导分化技术领域，具体技术涉及一种人多能干细胞向三维视网膜组织分化的程控化的诱导方法。

背景技术：

人多能干细胞(Human pluripotent stem cell,hPSC)，包括胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ESC)和诱导多能干细胞(Induced pluripotent stem cell,iPSC)具有多向分化的潜能，即在特定条件下可以定向分化为几乎机体所有的细胞。干细胞再生技术的突破为难治性疾病的发病机制、新药开发和细胞治疗等研究带来了前所未有的机遇。其中，体外诱导hPSC向视网膜细胞甚至组织分化的关键技术先后取得突破，成为干细胞体外再生器官的领跑者，相关的临床实验也正在紧锣密鼓的进行.。尤其是从2006年，SasaiY团队(Sasai Y,Cell stem cell,2012)率先报道了ESC自组装为视泡结构的研究后，hPSC向视网膜组织分化的研究进入了新的发展阶段。进一步，Zhong XF等研究人员(NatureCommu.2014)采用特定的视网膜诱导分化液，以小片状的hiPSC为起始分化细胞，首先悬浮培养获得细胞凝聚体，第7天再贴壁培养以获得片状或环状分布的NR/RPE，后者机械分离后再悬浮培养，也获得了三维立体的视网膜组织。3D诱导技术获得的视网膜组织具有早期人胚胎视网膜的形态特征和层次结构，包含有主要视网膜细胞类型，在药物筛选以及临床移植供体方面具有广阔的应用前景和市场开发潜力。

但是，由于hPSC(包括ESC和hiPSC等)本身具有的异质性特征，诱导分化过程中的不同步和飘忽不定的成功率也极大地制约了这项技术在临床上的应用。目前制约视网膜组织大规模诱导分化及临床应用的关键点主要包括以下几个：1)目前常用的诱导分化方案都不是普遍适用于所有的干细胞系，个别细胞系无法成功分化，这严重制约了今后实现同种同体移植的应用；2)多数方案以小片状的(大小及数量难以控制)，而非单个的hPSC为起始分化细胞,导致实验重复性差，难以实现规模化同质化生产；3)所有方案在起始分化阶段都使用了大量的干细胞，培养液、诱导因子、培养板等消耗量大，导致成本高，效率低，无法满足今后供药物筛选应用的数量要求；4)研究人员需要较长的培训时间来掌握此分化技术。

发明内容：

本发明针对现有诱导分化方案的局限性，如不能普遍适用，实验重复性差，分化同质性差，学习时间长等缺点，而提供了一种能使视网膜组织的诱导分化以及获取成为流水线操作，可实现工厂化生产，以供大规模临床应用或药物筛选的人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法。

本发明的人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法，包括将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体，拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其特征在于，

所述的将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体是将hPSCs消化成单细胞，然后收集细胞加入到培养容器中，细胞重聚形成拟胚体。

所述收集细胞加入到培养容器中优选是收集细胞按150～300个细胞构成1个拟胚体的比例将细胞加入到培养容器中。

所述的拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织优选在诱导分化过程中监测细胞的DKK-1表达情况，以将细胞加入到培养容器中构建拟胚体当天记为第0天，次日记为第1天，以此类推，如果DKK-1表达量在第3天-第28天基本满足对数增长，则无需额外添加DKK-1，如果DKK-1表达量在第22天前开始出现下降，则从第7天开始补充DKK-1蛋白直至第22天。