[发明专利]一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法

权利要求书

1.一种人多能干细胞分化为视网膜组织的简易高效可机械化的诱导方法，包括将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体，拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其特征在于，

所述的将hPSCs消化得到细胞沉淀，再将细胞沉淀培养得到拟胚体是将hPSCs消化成单细胞，然后收集细胞加入到培养容器中，细胞重聚形成拟胚体；

所述的拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织，其在诱导分化过程中监测细胞的DKK-1表达情况，以将细胞加入到培养容器中构建拟胚体当天记为第0天，次日记为第1天，以此类推，如果DKK-1表达量在第22天前开始出现下降，则从第7天开始补充DKK-1蛋白直至第22天；

所述收集细胞加入到培养容器中是收集细胞按150~300个细胞构成1个拟胚体的比例将细胞加入到培养容器中；

所述的从第7天开始补充DKK-1蛋白直至第22天，其DKK-1蛋白的补充量是每天一次，按每ml培养液补充100ng DKK-1蛋白的量补充。

2.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的将hPSCs消化成单细胞是取生长80% 融合度的 hPSCs，刮除分化细胞，吸去培养液，PBS润洗后用0.5mM EDTA 37℃消化6min，再吸除EDTA，用mTeSR1吹落细胞，并吹打分散为单个细胞，离心收集细胞，用mTeSR1培养液重悬细胞，得到细胞悬液，按150~300个细胞构成1个拟胚体的比例，以琼脂微孔板作为培养容器，将琼脂微孔板置于24 孔板中，每孔一个琼脂微孔板，按每个琼脂微孔板上的微孔制备1个拟胚体，每个微孔中加入含150~300个细胞的细胞悬液，37 ℃ CO₂培养箱中培养，待细胞均匀沉入微孔底后，沿着24孔板的孔壁与微孔板之间缓慢添加1.5 ml含有10μMBlebbistatin的mTeSR I培养液于每一孔继续培养。

3.根据权利要求1所述的诱导方法，其特征在于，所述的拟胚体经诱导分化得到3D视网膜组织具体为：以将细胞加入到培养容器中构建拟胚体当天记为第0天，次日记为第1天，以此类推，第1天，24孔板孔内培养液替换为体积分数25% NIM+体积分数75% mTeSR1，共1.5ml/孔，第2天，培养液替换为体积分数50% NIM+体积分数50% mTeSR1，共1.5ml/孔，并在这一天用Matrigel包被六孔板，37℃过夜，第3天，吸取六孔板中的Matrigel，加入NIM培养液4ml/孔，用无菌镊夹起24孔板中的1个琼脂微孔板倒扣到六孔板的1个孔中，并用移液枪吹打琼脂微孔板的加样槽，将拟胚体吹落，六孔板放入37 ℃ CO₂培养箱后，十字摇匀法摇匀，开始贴壁培养，第4-8天密切观察培养液性状，若无培养液发黄迹象可不更换培养液，第9天，全量更换NIM培养液，以去除死细胞，第10-15天，隔天更换NIM培养液，第16天，吸净NIM培养液，更换为RDM培养液，第17-28天，每日半量换RDM培养液，如果DKK-1表达量在第22天前开始出现下降，则从第7天开始每天补充一次DKK-1蛋白到培养液中，按每ml培养液补充100ng DKK-1蛋白的量补充，直至第22天；

所述的NIM培养液为DMEM/F12 500ml、100× N2 5ml、2mg/ml Heparin 0.5ml、100×MEM-NEAA 5ml；

所述的RDM培养液为DMEM/F12 300ml、DMEM basic 200ml、50× B27 without vitaminA 10ml、100× antibiotic and antimycotic 5ml、100× MEM-NEAA 5ml。