[发明专利]一种从人羊膜中制取干细胞的方法

说明书

本发明涉及一种从人羊膜中制取干细胞的方法，所述方法包括：采集胎盘、取人羊膜、分离人羊膜上皮细胞、分离人羊膜间充质干细胞、细胞培养和冻存。本发明制备的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞纯度高，培养后增殖快，为操作人员节省了大量时间，同时增加了每个人羊膜的利用率。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种从人羊膜中制取干细胞的方法。

背景技术

羊膜是胎盘的最内层，与人眼结膜组织结构相似，无血管、神经及淋巴，具有一定的弹性，厚约0.02-0.5mm，在电镜下分为五层，分别是：上皮层、基底膜、致密层、纤维母细胞层和海绵层，人羊膜中的干细胞主要包含人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞。

研究发现，人羊膜间充质干细胞具有与骨髓间充质干细胞相似的表型，增殖能力比骨髓间充质干细胞更强，同时，人羊膜无免疫原性，不会产生免疫排斥反应，因此，更适合用于细胞培养，而羊膜属于分娩后的废弃物，不涉及医学伦理和法律问题，是组织工程和细胞治疗的理想种子细胞，目前，原代人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞的提取方法主要是酶解法，利用相应的酶对人羊膜进行消化，再进行接种培养，该方法分离人羊膜时，往往将人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞一同分离下来，导致人羊膜上皮细胞与人羊膜间充质干细胞混杂在一起，不易分开，很难获得纯净的细胞系，影响接下来的细胞培养和应用过程，现有技术使用细胞刮刀将混合细胞中的上皮细胞分离出来，但该方法存在增加污染率和分离不彻底的问题，现有技术中通过不同的酶解法从不同的人羊膜上分离原代人羊膜间充质干细胞或人羊膜上皮细胞，该方法限制了每个人羊膜只能分离得到一种细胞，造成资源浪费。

发明内容

针对以上人羊膜细胞的分离过程中存在的大量问题，本发明提供了一种从人羊膜中制取干细胞的方法，该方法分离培养的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞纯度高，同时培养后的人羊膜间充质干细胞和人羊膜上皮细胞增殖快，为操作人员节省了大量时间。

本发明具体技术方案如下：

一种从人羊膜间充质干细胞分离培养方法，该方法包括以下步骤：

1)采集胎盘：取新鲜采集的胎盘，去除残留的绒毛膜，置于体积比为5:1的0.9％的氯化钠注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：将步骤1)所得的胎盘放置于圆盘中，用0.9％的氯化钠注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整个人羊膜，清洗干净；

3)分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm2的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒5-15mL细胞分离液将人羊膜全部浸润，20min后，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入15-30mL体积比为2:1的质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于30-45℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入20-40mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为4-6的60％的泛影葡胺、重量份数为8-10的青霉素和重量份数为40-50的TritonX-100；

4)分离人羊膜间充质干细胞：将步骤3)分离人羊膜上皮细胞后的人羊膜放置于第二培养皿中，加入质量浓度为0.14％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，再加入质量浓度为0.5％的Ⅳ型胶原酶消化至羊膜组织溶化，加入PBS缓冲液稀释，离心，得组织匀浆，离心，弃上清，收集下层的人羊膜间充质干细胞；