[发明专利]一种从人羊膜中制取干细胞的方法

权利要求书

1.一种从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)采集胎盘：取新鲜采集的胎盘，去除残留的绒毛膜，置于体积比为5:1的0.9％的氯化钠注射液和25％的乙醇溶液的混合溶液中清洗2min，再放置于PBS溶液中清洗1min，取出待用；

2)取人羊膜：将步骤1)所得的胎盘放置于圆盘中，用0.9％的氯化钠注射液浸泡5min，取出，完整的撕取整个人羊膜，清洗干净；

3)分离人羊膜上皮细胞：将步骤2)所得的人羊膜裁剪成100mm2的块状，将裁剪后的人羊膜上皮面朝上贴敷于无菌硝酸纤维膜上，向贴敷于无菌硝酸纤维膜上的人羊膜喷洒5-15mL细胞分离液将人羊膜全部浸润，20min后，将人羊膜放置于第一培养皿中，加入15-30mL体积比为2:1的质量浓度为1mg/mL的Ⅱ型胶原酶和质量浓度为1mg/mL的DNA酶的混合溶液预消化20min，再在第一培养皿中加入3.5mg/mL的pH为7.5的胰蛋白酶，放置于30-45℃摇床中消化6.5min，消化结束后，向第一培养皿中加入20-40mL 8％FBS培养基终止消化，得细胞培养液，再将人羊膜放置于30mL生理盐水中洗涤5次，每次5min，收集洗涤液和培养液，过300μm细胞筛网，离心，弃上清，收集下层的人羊膜上皮细胞；其中，所述细胞分离液包括重量份数为4-6的60％的泛影葡胺、重量份数为8-10的青霉素和重量份数为40-50的TritonX-100；

4)分离人羊膜间充质干细胞：将步骤3)分离人羊膜上皮细胞后的人羊膜放置于第二培养皿中，加入质量浓度为0.14％的胰蛋白酶进行消化，消化后的羊膜组织用PBS缓冲液冲洗，再加入质量浓度为0.5％的Ⅳ型胶原酶消化至羊膜组织溶化，加入PBS缓冲液稀释，离心，得组织匀浆，离心，弃上清，收集下层的人羊膜间充质干细胞；

5)细胞培养：分别将步骤3)和步骤4)所得的人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞调整细胞密度为2×106，接种到培养瓶中进行细胞原代培养和传代培养；

6)冻存：将步骤5)所得的培养后的细胞进行冻存，即得冻存人羊膜上皮细胞和冻存人羊膜间充质干细胞。

2.如权利要求1所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，步骤5)中所述细胞原代培养的具体方法为：在培养瓶中加入原代培养基，放置于二氧化碳恒温恒湿培养箱中，于38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞培养，培养时间为一周，隔1-2天对原代培养基进行一次全量换液，待细胞长满瓶底65％-75％时，加入1mg/mL的胰蛋白酶消化细胞，待细胞变圆，立即终止消化，分离，收获原代干细胞。

3.如权利要求2所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，步骤5)中所述细胞传代培养的具体方法为：将获得的原代干细胞重悬于传代培养基中，放置于培养箱中，在38±0.5℃、二氧化碳体积分数为5±0.2％的条件下进行细胞传代培养。

4.如权利要求2所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述原代培养基以L-15培养基为基础，还包含以下浓度组分：100-250ng/mL的NGF、300-550ng/mL的天冬酰胺和200-500ng/mL的氯化钠。

5.如权利要求3所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述传代培养基以AIM-V培养基为基础，还包括以下浓度组分：100-200ng/mL的6-苄氨基嘌呤、300-500ng/mL的白细胞介素Ⅱ和100-150ng/mL的蚕豆蛋白。

6.如权利要求1所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，步骤6)中所述细胞冻存的具体方法为：收集细胞并加入冻存液，将其装于冻存管中，放入程序降温盒后置于-80℃冰箱中，3-5h后，再将冻存管冻于液氮中。

7.如权利要求1所述从人羊膜中制取干细胞的方法，所述离心速度为1000rpm。

8.如权利要求6所述的从人羊膜中制取干细胞的方法，其特征在于，所述冻存液包含以下浓度组分：5-15mL/L的knock-out血清、5-50mL/L的羟乙基淀粉和12-20mL/L右旋糖苷。