[发明专利]一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种人来源血凝调节蛋白的制备方法，特别涉及一种可工业化生产的人 来源血凝调节蛋白的大规模制备新方法。

背景技术

血凝调节蛋白(Thrombomodulin，TM)又称凝血酶调节蛋白，是存在于血管内皮 细胞膜上的单链跨膜糖蛋白，完整分子的相对分子质量为75,000Da，降解二硫键后相对 分子质量为105,000Da，由575个氨基酸组成。TM最初由N.L.Esmon等于1981年在实验中 发现，其结构包括一个氨基端的植物凝集样结构域，6个重复排列的内皮生长因子 (endothelial growth factor，EGF)样结构域，一个丝氨酸/苏氨酸富集区(疏水区域)， 一个跨膜区和一个短的细胞内尾端。凝血酶调节蛋白的结构如图3所示。

TM因具有强力的血液凝固阻断作用而为人所知，其通过与凝血酶特异性结合来阻 断凝血酶的血液凝固活性，同时TM能够显著促进凝血酶的蛋白质C(Protein C，PC)的 活化，是PC抗凝途径的重要辅因子。临床上TM能够预防与治疗冠状动脉综合症(ACS)、 血栓症、外周血管阻塞、闭塞性动脉硬化、血管炎、心脏手术后的功能性障碍、器官移 植、心绞痛、短暂性脑缺血引起的并发症、妊娠毒血症、糖尿病、肝静脉阻塞病(liver VOD)、深静脉血栓(DVT)，急性呼吸窘迫综合症(ARDS)等。目前，主要是用于 凝血系统紊乱而致的弥散性血管内凝血(DIC)。

TM不仅是重要的抗凝辅助因子，也是反映血管内皮细胞损伤的分子标志，多种累 及血管内皮损伤的疾病，如系统性红斑狼疮、糖尿病、白血病等，TM都有增高；越来 越多的研究表明，TM可作为一种具有实际应用价值新的肿瘤标志物。因此，TM具有很 高的临床应用价值。

TM有两种存在形式：固定型(膜型)和溶解型(血液型)。前者存在于细胞表面， 后者游离于血浆和尿液中。溶解型TM(soluble thrombomodulin，sTM)由557个氨基酸 残基构成，分子量约为60,300D，等电点约为3.8，其结构是固定型TM去除部分或全部的 跨膜区域，sTM与天然TM具有相同的功效和理化性质。研究显示在人血浆中TM含量为 292±60ng/mL，人尿中TM含量为102±38ng/mL。

据报道，TM已经能从胎盘、肺和血液中提取出来，但是他们不适于大规模生产， 除此之外，制备TM的原料在处理过程中常常需要外源加入表面活性剂、去污剂等物质， 处理过程较为复杂，且容易带入污染物，为后续纯化增加难度。以考虑到TM在药品中 的应用为前提，需要大量地且以更低成本来获得可溶性血栓调节蛋白，目前有市售的日 本旭化成公司的重组可溶性TM，但TM是一种糖蛋白，通过基因工程技术无法制备与天 然结构具有相同糖链的目标蛋白，糖链的差异可能导致蛋白具有截然相反的生物功能， 导致蛋白药物具有负面效应。

另有多个文献报道人尿适于用作分离天然型TM的起始原料，例如Yamamoto等纯化 TM的过程使用了QAE交联葡聚糖，抗TM单克隆抗体柱，凝血酶作为配体的亲和柱和交 联葡聚糖G-200，但由于此方法需要制备单克隆抗体，过程较为复杂。再如D.E.Jackson 等纯化TM时结合使用了DEAE琼脂糖凝胶，凝血酶作为配体的亲和柱和反向HPLC，此 方法中反向HPLC产量低且不适于大规模纯化，另外，Aoki等(日本专利申请公开 No.Sho-63-30423)和Kunihiro等(日本专利申请公开No.Sho-63-218399)报道了从新鲜 尿液中纯化TM的方法，使用了离子交换色谱，凝血酶结合的亲和柱和凝胶渗透，结果 证明当TM含量很低时，此方法不适用。综上可以看出目前从人尿中提取TM的各种纯化 方法均表现为产量低且不适于大规模工业化生产。

发明内容

发明目的：为了能够简单方便、成本低、收率高的大规模工业化生产得到无异源蛋 白污染、更安全可靠、生物活性高、无免疫原性、质量稳定的纯人源性血凝调节蛋白， 本发明提供了一种可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法。

技术方案：本发明所述的可工业化生产的人来源血凝调节蛋白的制备方法，包括将 从人尿中提取的尿蛋白浓缩液依次经金属螯合亲和层析柱、阴离子层析柱、凝血酶亲和 层析柱、疏水层析柱层析，得到血凝调节蛋白。

所述的尿蛋白浓缩液由以下步骤制备得到：利用离子交换树脂作为吸附剂吸附尿液 中的尿蛋白，清洗、解吸附，超滤浓缩，即得尿蛋白浓缩液。其中，所述的离子交换树 脂优选为大孔径离子交换树脂。