[发明专利]单域抗体融合蛋白及其应用

说明书

本发明提供了一种单域抗体融合蛋白，包括与细胞因子融合的一个或多个单域抗体，尤其是与IL‑12或IL‑2融合的一个或多个抗PD‑1单域抗体。本发明还提供了该单域抗体融合蛋白在制备治疗肿瘤的药物中的应用。本发明的融合蛋白将单域抗体的分子小、渗透性好、稳定性高等优点与细胞因子的免疫调节等活性结合，具有更佳的抗肿瘤效果。

技术领域

本发明涉及一种融合蛋白，尤其是包括抗PD-1单域抗体和细胞因子的融合蛋白。

背景技术

哺乳动物细胞中，免疫系统要受到免疫检查点的调控。有两类免疫调控因子参与这个通路，包括共刺激信号和共抑制信号分子(1)。在健康的人体细胞中，免疫系统的 T细胞活性因为受到免疫检查点抑制因子的严密调节而被抑制，从而避免自身免疫和过度活跃的炎症应答的摧毁效应。但是，癌变的细胞也会利用这种抑制通路来躲避免疫识别和摧毁。为了能够利用免疫系统摧毁癌细胞，就需要消除这种免疫抑制效应，从而移除免疫检查点的抑制作用(2,3)。当前，能够特异性的结合抑制因子的单克隆抗体已经被用来重新激活受到抑制的T细胞，并且恢复它们的抗肿瘤活性。因此，这种治疗方案就发展成了最近的癌症免疫疗法。

有一大类免疫检查点的分子能够结合相应的受体蛋白，其中包括细胞毒性T淋巴细胞相关联抗原4(CTLA-4)分子、程序性死亡1(PD-1)分子、淋巴细胞活化基因 3(LAG-3)分子、T细胞免疫球蛋白及粘蛋白3(TIM-3)、以及其它分子(4)。它们中的一些已经被用于开发治疗癌症的抗体。作为一种结合CTLA-4分子的全人免疫球蛋白G1单克隆抗体，Ipilimumab(商品名为Yervoy)抗体是第一款用于治疗转移性黑素瘤病人并显著提高其生存率的抗体治疗措施。尤其是最近，作为一种结合PD-1分子的人源化的IgG4单克隆抗体，pembrolizumab(商品名为Keytruda)抗体已经被加速通过审批用于治疗病人，包括不可切除的或转移性黑色素瘤病人或肺癌病人，或者经过 Ipilimumab疗程后BRAF V600突变指标是阳性的病人。此外，抗PD-1的另外一种 IgG4单克隆抗体nivolumab(商品名为Opdivo)最近也获得了FDA通过并用于免疫治疗。

目前上市的治疗性PD-1抗体，例如pembrolizumab和nivolumab都是IgG4单克隆抗体，与IgG1类抗体相比，具有非常有限的抗体依赖的细胞毒(ADCC)活性和补体依赖的细胞毒(CDC)活性(5)。既然以上两种PD-1单克隆抗体的活性都不依赖于调控IgG 受体功能的Fc区域，所以针对这类PD-1单克隆抗体的改造优化，其中一种方式就是设计没有Fc区域的抗体片段，比如单链抗体(scFv)或Fab片段等。即便如此，现有治疗性抗体依然存在分子量过大、稳定性差以及治疗量效果有限等问题。

发明内容

为了克服上述问题，在一方面，本发明提供了一种具有抗肿瘤活性的单域抗体融合蛋白，其包括与细胞因子融合的一个或多个单域抗体。

在一个实施方案中，所述单域抗体为抗PD-1单域抗体。

在一个实施方案中，所述细胞因子选自IL-2、IL-12和GM-CSF。

在一个实施方案中，所述单域抗体和所述细胞因子之间通过接头序列连接。

在一个实施方案中，所述IL-12的两个亚基P35和P40通过接头序列连接形成IL-12单链蛋白而存在于所述单域抗体融合蛋白中。

在一个实施方案中，所述细胞因子为IL-12，所述抗PD-1单域抗体为两个，它们在所述单域抗体融合蛋白中位于IL-12的同侧或者分别位于IL-12的两侧。

在一个实施方案中，所述接头序列为(Gly4Ser)3。

在一个具体实施方案中，所述抗PD-1单域抗体具有如SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列。

在一个具体实施方案中，所述IL-12单链蛋白具有如SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。