[发明专利]一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药

说明书

本发明公开了一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药，解决了由于杂蛋白过多，胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶很难分开，导致胰蛋白酶提取的纯度一直不高的问题，其技术方案要点包括有如下步骤：将动物胰脏切块搅碎加入到提取罐中提取；离心分层，压滤得到胰脏提取液；超滤浓缩后，加入（NH₄）₂SO₄梯度盐析，得到胰酶混合物；加入胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B‑鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过Tris‑HCl缓冲液平衡；用0.1mol/L甲酸‑0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂，能够得到高纯度的胰蛋白酶产品。

技术领域

本发明涉及生物制药，特别涉及一种胰蛋白酶的提取方法及含有胰蛋白酶的原料药。

背景技术

胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中，在Ca²⁺的存在下，被肠激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链N端赖氨酸和异亮氨酸残基之间的肽键断开，失去一段六肽，分子构象发生一定改变后转变为有活性的胰蛋白酶。

胰蛋白酶原的分子量约为24000，其等电点约为pH8.9；胰蛋白酶的分子量与其酶原接近(23300)，其等电点约为pH10.8，最适pH7.6～8.0，在pH＝3时最稳定，低于此pH时，胰蛋白酶易变性，在pH5时易自溶。Ca²⁺离子对胰蛋白酶有稳定作用。

从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来，然后再根据等电点沉淀的原理，调节pH以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再以硫酸铵分级盐析将胰酶沉淀，活化后采用层析、沉淀等方法再次纯化。由于杂蛋白过多，且胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶很难分开，导致胰蛋白酶提取的纯度一直不高。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种胰蛋白酶的提取方法，对胰蛋白酶进行提取，能够得到高纯度的胰蛋白酶产品。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一种胰蛋白酶的提取方法，包括有如下步骤：

步骤一：将动物胰脏预处理去除结缔组织和脂肪，切块搅碎，得到胰糜；

步骤二：将胰糜加入到提取罐中加乙酸酸化水至浸没胰糜，搅拌混合后，得到胰糜-水混合物；

步骤三：将胰糜-水混合物离心至分层，并对沉淀进行压滤，将压滤得到的清液与离心得到的上清液混合后得到胰脏提取液；

步骤四：对胰脏提取液进行超滤浓缩后，加入(NH₄)₂SO₄梯度盐析，得到胰酶混合物；

步骤五：将胰酶混合物经过压滤后取滤饼，均匀向滤饼中加入0.1mol/L CaCl₂溶液至滤饼完全溶解，加入胰蛋白酶晶体进行激活，得到胰酶粗提液；

步骤六：将胰酶粗提液压滤后取上清液再次超滤浓缩，得到胰酶浓缩液；

步骤七：活化Sepharose 4B并与鸡卵粘蛋白偶联，将Sepharose 4B-鸡卵粘蛋白混合物装柱，并通过Tris-HCl缓冲液平衡；

步骤八：将胰酶浓缩液过柱去除杂蛋白，用0.1mol/L甲酸-0.5mol/L KCl溶液洗脱，收集位于洗脱峰的流出液，得到胰蛋白酶精提液；

步骤九：将胰蛋白酶精提液脱盐过滤后，冻干成粉，即得到胰蛋白酶干粉制剂。