[发明专利]一种驴精液冷冻保存的方法

权利要求书

1.一种驴精液冷冻保存的方法，其特征在于该方法包括步骤如下：

(1)配置稀释液

①基础液配置：所述基础液包括按质量份数构成的下述组份：Tris 3.04份、柠檬酸1.70份、葡萄糖1.50份、果糖1.50份、青霉素0.06份，链霉素0.10份、双蒸水100份，将上述组份定容配置成基础液；

②稀释Ⅰ液配置：按体积计取基础液85份，取新鲜卵黄液15份，充分混匀，得到稀释Ⅰ液；

③稀释Ⅱ液配置：按体积计取上述稀释Ⅰ液80份，取0.5mg/mL氧化石墨烯20份，充分混匀，得到稀释Ⅱ液；

④冷冻液配置：按体积计取上述稀释Ⅱ液46份，取甘油4份，充分混匀，得到冷冻液；

(2)鲜精的处理

①以发情母驴作为台驴，假阴道法采集种公驴精液，采集的精液立即用6-8层无菌纱布过滤并收集到无菌烧杯中并封口，同时以显微镜检查精子密度和活率，精子活率大于0.70为符合标准的鲜精；

②将符合标准的鲜精和稀释Ⅱ液一并放置在35℃恒温培养箱内维持1-2h，然后，吸取5mL鲜精转移至15mL无菌试管中，2500rpm离心5min，弃上清液，沿管壁缓慢加入5mL稀释Ⅱ液，混合均匀得到稀释鲜精；

(3)精液的降温和平衡

将上述密封好的稀释鲜精与冷冻稀释液一并放入盛有35℃水的烧杯中，置4℃冰箱降温6-10h，然后将已冷至4℃的冷冻稀释液吸取5mL缓慢加入降温后的精液中，混合均匀后放回4℃冰箱，平衡2小时，得到平衡后的精液；

(4)精液的冷冻及解冻

①精液冷冻，将上述平衡后的精液在4℃条件下装入0.25mL的麦管中，置-80℃超低温冰箱中20-40min，然后投入液氮冷冻保存；

②精液解冻，取冷冻后的精液放入60℃水浴中6秒进行解冻，解冻后，置37℃载物台的显微镜下(400×)观察精子的活率。

2.根据权利要求1所述的驴精液冷冻保存的方法，其特征在于：所述步骤(1)的②、③及④步中按体积计取基础液、取新鲜卵黄液、取稀释Ⅰ液、取0.5mg/mL氧化石墨烯、取稀释Ⅱ液及取甘油均是采用20mL无菌注射器吸取。