[发明专利]用于生物纳米探针的SEM/ESEM阴极荧光成像方法

说明书

用于生物纳米探针的SEM/ESEM—阴极荧光成像方法属于阴极荧光成像技术领域，尤其涉及生物荧光成像技术领域，其特征在于，采用SEM/ESEM和CL组成的联机系统，包括量子点和纳米颗粒在内的纳米探针，选择包括玻璃、导电玻璃、SiO₂‑Au‑Si复合膜、Si、SiO₂、碳基薄膜在内的任何一种衬底，以SEM外接模式、配以阴极荧光谱的CL全光模式，得到CL像和相对应的SE或TE电子像，以及CL像和电子像的合成像，以SEM快速扫描模式、配以阴极荧光谱的CL单光模式，得到单细胞的CL谱，或单一波长的CL单光像和各电子像，从而得到了由纳米颗粒/量子点探针特异性标识的单细胞和单分子的高分辨光子像和对应的电子像，可以在室温～‑180℃下低温成像，还可以与具有不同发光特性的荧光分子/荧光蛋白探针匹配，并减少高能电子束对生物样品的辐照损伤。

技术领域

本发明属于阴极荧光成像技术领域，尤其涉及生物荧光成像技术领域，采用扫描电子显微镜SEM和阴极荧光谱仪CL联机系统，接收电子束激发产生的荧光信号，以及二次电子、背散射电子和透射电子信号，获得由纳米颗粒或半导体量子点探针特异性标记的高分辨和高灵敏度的阴极荧光CL像和对应的电子像，以及单细胞发出的紫外-可见光-红外波段的CL谱，采用电子像和光子像的合成像，以及改变细胞样品衬底的方法，获得衬度增强的CL像，以十几纳米的分辨率显示单个蛋白等单分子在单细胞表面和内部的位置和分布。此方法适用于各类由高分辨场发射扫描电镜/环境扫描电镜和高灵敏阴极荧光谱仪构成的观测系统，纳米颗粒、量子点、荧光染料分子和荧光蛋白等荧光探针标记的生物组织结构，以及半导体、纳米材料、矿物、无机、有机物等各类纳米-微米尺度的发光材料。

背景技术

扫描电子显微镜SEM，简称SEM，以下同，是以高能电子束为激发源，对各种固体材料，包括生物样品进行高分辨成像的设备。SEM与阴极荧光谱仪CL，简称CL，以下同，构成的观测系统SEM-CL，可获得发光材料的光子像和对应的电子像。因此，CL谱仪技术在多种学科和工程技术领域已到广泛应用，并具有潜在的应用前景。目前，CL技术多用于地质矿物、半导体和IT产业、纳米科技、光电子器件、生物药物等学科和技术领域。随着电子显微镜技术的快速发展，由高分辨扫描电镜和高精度阴极荧光谱仪构成的SEM-CL系统，有望在细胞生物学领域得到应用，例如获得以生物纳米探针特异性标定的细胞组织的高分辨荧光像和对应的电子像。

在SEM中，高能入射电子与固体样品相互作用，会从样品中激发产生多种信号，主要包括二次电子SE、背散射电子BSE、吸收电子AE、透射电子TE、阴极荧光CL、特征-X射线、电子束感生电流EBIC等(图2)。其中二次电子SE的作用深度最浅，约10nm，形成高分辨像。上述信号形成的电子像，如SE像、BSE像、TE像，以及光子CL像和X-射线元素分布像在材料科学和生命科学领域已得广泛和深入的研究和应用。

生物荧光成像技术是细胞免疫学、分子生物学、分子遗传学、肿瘤学、病理学等生物医药学科普遍采用的可视化研究手段，在疾病诊断、临床检验和治疗、药物研发等方面发挥着重要作用。目前用于生物荧光成像的主要仪器是以光作为激发源的光学显微镜，包括荧光显微镜(FM)，激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)，以及最新发展的超高分辨光学显微镜(如，STORM等)。根据Abbe成像原理，普通光学显微镜受到光衍射极限的限制，只能达到亚微米级(～200nm)的分辨率。超高分辨光学显微镜利用受激辐射耗尽和单分子定位重构等技术，突破了光学衍射极限，达到数十纳米的分辨率(～20nm)。因此，2014年的诺贝尔化学奖颁发给了此项发明的Eric Betzig，Stefan W.Hell，和William E.Moemer三位科学家。在此之前的2008年，诺贝尔化学奖颁给了Osamu，Shimomura，Martin Chalfie，和Roger Y.Tsien(钱永健)等科学家，表彰他们发现和发展了用于活细胞荧光成像的绿色荧光蛋白(GFP，EGFP)。这些先进的生物荧光可视化技术极大推动了生物医药学的发展，为医药学研究做出了突出贡献。