[发明专利]一种苦荞籽粒RNA的快速提取方法

说明书

技术领域

本发明属于生物基因技术领域，具体涉及一种苦荞籽粒RNA的快速提取方法。

背景技术

苦荞，又名鞑靼荞麦，属于蓼科荞麦属，是一种药食两用性作物，苦荞的活性成分富含黄酮类化合物、酚类化合物、肌醇、弱碱性淀粉和活性蛋白，是能当饭吃的食品，且其营养成分丰富，本身就富含硒，可以对人体起到自然补充硒的作用，有着卓越的营养保健价值和非凡的食疗功效。我国苦荞种植面积和产量均居世界第一位，主要生长在我国的西南山区，四川地区的苦荞茶也流传甚广。

RNA的提取是分子生物学研究的一个重要组成部分，是提取无污染的完整的RNA是进行基因表达分析和基因克隆的必要条件，从细胞中分离RNA的纯度与完整性对后续进行Northern杂交分析、RT-PCR及蛋白质的体外翻译等分子生物学研究都至关重要。然而，由于植物细胞具有坚硬的细胞壁，且植物细胞内含有多酚、多糖、萜类或其它无法确定的次级代谢产物，在完整的细胞内这些物质与核酸是相互分离的，但当组织被研磨，细胞被破碎后，这些物质就会与RNA相互作用，因而从植物组织中极难分离出高质量的RNA。

中国专利文献CN 106967711 A中公布了一种荞麦RNA的优化提取方法，其采用CTAB提取缓冲溶液提取荞麦根、茎和叶不同部位的RNA，能够去除多糖和酚类等物质，获得了较高浓度的和纯度的RNA，然而该方法采用高盐浓度的缓冲液体系，在很好溶解DNA的同时也造成了部分RNA的损失，且其采用传统的氯仿-异戊醇萃取步骤，需要进行多步重复萃取才能获得纯度高的RNA，不仅耗时耗力，而且易造成RNA的损失，提取效率较低，且其在4℃下经多次离心，裂解液容易变粘稠而不易吸取，其采用高压湿热灭菌消毒，耗费时间较长。另外，由于同一种方法在不同植物组织中提取效果有所差异；即使同一种植物的不同组织其RNA提取方法也会有很大的不同，因而CN 106967711A的方法并不适用于苦荞籽粒的提取，提取效果较差。

发明内容

本发明的目的就是为了解决上述技术问题，而提供一种苦荞籽粒RNA的快速提取方法，本发明的提取方法经电泳检测时条带清晰，RNA完整性好，OD₂₆₀/OD₂₈₀的比值在1.8～2.0之间，能够获得较高纯度的RNA，且RNA损失少，提取浓度高，RNA产率高，可用于基因表达分析或分子克隆等分子生物学研究。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：一种苦荞籽粒RNA的快速提取方法，包括以下步骤：

(1)灭菌处理：对所用器皿和器具进行乙醇灼烧灭菌，并在操作前预冷；

(2)在离心管中加入65℃预热后的CTAB提取液，然后加入β-巯基乙醇混匀，再加入研磨成粉末状的苦荞籽粒样品进行剧烈混匀；所述CTAB提取液配方为：2％CTAB(W/V)，60mM Tris-HCl，25mM EDTA，15％无水乙醇，pH为8.0；

(3)将离心管置于65℃水浴处理15～20min，水浴完毕后取出，于常温下12000rpm离心10min；

(4)吸取步骤(3)离心后所得上清液于新管，加入等体积的配比为24:1的氯仿-异戊醇混合液，混匀1min，然后加入pH为4.6的醋酸钾使其终浓度为1.2M，充分混匀后冰浴15min，常温下12000rpm离心10min，吸取上清液于新管；

(5)向步骤(4)离心后所得上清液中加入等体积的LiCl溶液使其管内终浓度为2M，-20℃下静置沉淀2h，取出于4℃下12000rpm离心10min，倾弃液体，将管底沉淀物用乙醇漂洗，短离心后晾干乙醇，向沉淀物中加入重蒸水溶解，做电泳检测。

本发明提供的上述苦荞籽粒RNA提取方法，充分利用了CTAB的较强洗涤性能，通过CTAB提取液配方，能够从苦荞籽粒的细胞膜和蛋白质中释放RNA，在CTAB提取液体系中，蛋白质和大多数多聚糖可与CTAB形成复合物而沉淀除去，同时CTAB破坏了蛋白质在水中存在的两个因素(水化层和电荷)，蛋白质和杂质除去效果好。此时核酸无法沉淀出来，在后续的离心和萃取过程中再进一步除去DNA和酚类物质，从而获得高质量的RNA提取物。在步骤(2)的CTAB提取液中加入15％的无水乙醇(指无水乙醇的体积占提取液总体积的15％)是非常必要的，加入的无水乙醇可以使RNA更好的分离溶解，大大减少沉淀过程中RNA的损失。在本发明的探索实验中，没有加入无水乙醇(总体积的15％)的情况下，最终得到的RNA质量和产率均不高。