[发明专利]一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法

说明书

本发明公开了一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法，该质粒miRNA序列与人源、小鼠和大鼠数据库中已公布的序列不存在同源，质粒作为人源、小鼠和大鼠miRNA干扰的对照组实验，有较准确的对照参照组实验意义，质粒含有经过特异筛选的目标序列，目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。该特异序列对人源、小鼠和大鼠类序列miRNA序列的功能筛选，有较准确的对照参照组实验意义，转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用，使实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断，有效的筛选到理想的miRNA。

技术领域

本发明属于分子生物学与基因工程技术领域，涉及一种在miRNA筛选过程中需要的一种绝对对照的对照组实验质粒。具体地说本发明涉及一种用于人源、小鼠、大鼠等筛选高效miRNA序列质粒的绝对对照组实验质粒。

背景技术

MicroRNA(miRNA)是一类内生的、长度约为20～24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNA也可以调节同一个基因。这种复杂的调节网络既可以通过一个miRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个miRNA的组合来精细调控某个基因的表达。据推测，miRNA调节着人类三分之一的基因。最近的研究表明大约70％的哺乳动物miRNA是位于TUs区(transcription,TUs)(Rodriguez etal,2004),且其中大部分是位于内含子区(Kim&Nam,2006)。一些内含子miRNA的位置在不同的物种中是高度保守的。miRNA不仅在基因位置上保守,序列上也呈现出高度的同源性(Pasquinelli etal,2000；Ruvkun et al,2001；Lee&Ambros,2001)。miRNA高度的保守性与其功能的重要性有着密切的关系。miRNA与其靶基因的进化有着密切的联系,研究其进化历史有助于进一步了解其作用机制和功能。

目前现有技术中已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21～25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。

发明内容

本发明为了克服现有技术存在的不足，提供一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒及其构建方法。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒，该质粒miRNA序列与人源、小鼠和大鼠数据库中已公布的序列不存在同源，质粒作为人源、小鼠和大鼠miRNA干扰的对照组实验，有较准确的对照参照组实验意义，该质粒含有经过特异筛选的目标序列，目标序列为CCTAGGTTAAGTCGCCCTCGT。

质粒转录出的miRNA不对人源、小鼠和大鼠的蛋白表达起正调控或者负调控作用，是实验组的miRNA干扰作用能较明显的做出判断，从而筛选到理想的miRNA。

miRNA干扰载体表达出的miRNA具有经过基因工程改良的murine miR-155骨架结构，其中靶向结合序列在图1中以粗体字标出，进一步剪切成熟后结合目标基因miRNA发挥干扰作用。

而本发明中构建的质粒因对人源、小鼠和大鼠等数据库中已公布的序列不存在同源，所以能作为人源、小鼠和大鼠等miRNA干扰的良好对照组实验。质粒针对靶基因miRNA的干扰载体，在转染效率>80％的前提下，对实验中的转录水平无明显干扰作用。

一种用于miRNA干扰载体构建筛选特异对照的质粒的构建方法，具体包括如下步骤：

(1)预测一段21bp的序列，对人源、小鼠和大鼠的数据库用局部序列比对基本检索工具blast进行比对检索，找到大于90％特异与人源、小鼠和大鼠数据库的序列；