[发明专利]一种从经血中分离宫内膜间充质干细胞的方法

说明书

本发明提供了一种从月经血中快速高效分离宫内膜间充质干细胞的方法，所述方法为：收集月经血离心除去上层血浆，沉淀a中加入溶液Ⅰ，迅速混匀后，静置1～3分钟，而后加入溶液Ⅱ，混匀后离心，去上清液，获得的沉淀b用培养液悬浮，接种至细胞培养瓶中，48h后换液，除去未贴壁细胞，而后每2～3天换液，长至90％汇合时，消化传代，收集P3代细胞，即为纯化的EnMSCs。利用本发明方法所得EnMSCs在纯度方面与传统方法相比无差异，但本发明所述方法制备时间更短，分离过程耗时不超过15min，本方法所用分离试剂成分简单可控，操作方便，在降低制备成本的同时也提高了安全性。

(一)技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种从月经血中快速高效分离宫内膜间充质干细胞的方法。

(二)背景技术

干细胞是一类具有自我更新与增殖分化能力的细胞，在细胞和组织修复，以及作为基因治疗的载体等方面有巨大的应用价值。间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)来源广泛、可塑性强，同时拥有易于分离培养、多种因子分泌功能以及免疫调节功能等诸多优点，是目前干细胞领域的研究热点。诸多研究表明MSCs在组织损伤修复和各种疾病治疗方面有良好的应用前景，包括参与骨、软骨和肌腱等组织缺损修复、改善心肌梗死模型的心脏功能、降低急性肺损伤程度、促进糖尿病模型中的葡萄糖调节恢复、降低药物诱导的肝纤维化水平、以及促进神经元再生、皮肤再生和伤口愈合等。

研究发现除了骨髓、脐带、脂肪等组织，月经血中也存在丰富的宫内膜来源间充质干细胞(EnMSCs)，由于其体外增殖能力强(可增殖390次，传代50次)，分化潜能大，免疫原性低，生长因子分泌速率高等优点而受到再生医学研究领域的关注。目前EnMSCs分离主要利用淋巴细胞分离液、羟乙基淀粉等除去经血中红细胞，获得有核细胞，并进一步通过贴壁培养方法获得，分离过程耗时较长，所用试剂成分复杂。因此，进一步研究和开发高效的EnMSCs分离技术，缩短分离时间、减少外源引入试剂成分、降低分离成本，对于促进EnMSCs制备的产业化和提高EnMSCs应用安全性具有重要意义。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种从月经血中快速高效分离EnMSCs的方法。

本发明采用的技术方案为：

本发明提供一种从经血中快速高效分离宫内膜间充质干细胞的方法，所述方法为：收集月经血，离心(优选1000rpm离心3min)除去上层血浆，获得沉淀a；向沉淀a中加入溶液Ⅰ，迅速混匀后，静置1-3min，而后加入溶液Ⅱ，混匀后，离心(优选1000rpm离心5min)去上清液，获得沉淀b；将沉淀b用细胞培养液悬浮，于37℃，含5％CO₂培养箱中培养，48h后倾倒除去未贴壁细胞，换新鲜细胞培养液，而后每2～3天换液，待细胞长至90％汇合时，消化传代，收集第3代细胞，即为宫内膜间充质干细胞(EnMSCs)；所述溶液Ⅰ为(1～3)g/L的NaCl水溶液；所述溶液Ⅱ为(15～17)g/L的NaCl水溶液；所述细胞培养液组成为：含体积浓度2％的血清替代物(购自PALL公司)的MEM alpha基础培养液(购自Invitrogen公司)。

进一步，所述溶液Ⅰ与溶液Ⅱ体积比为1:1。

进一步，所述沉淀b用细胞培养液悬浮后，以2×10⁵/cm²密度接种至25cm²塑料细胞培养瓶中。

进一步，所述溶液Ⅰ与沉淀a的体积比为3～5：1，优选4：1。

进一步，所述溶液Ⅰ为2g/L的NaCl水溶液，去离子水配制，高压灭菌，NaCl粉剂可由市购获得。

进一步，所述溶液Ⅱ为16g/L的NaCl水溶液，去离子水配制，高压灭菌，NaCl粉剂可由市购获得。

本发明所述沉淀a和沉淀b均为沉淀，为了区分不同步骤获得的沉淀不同而命名，字母本身没有含义。