[发明专利]一种富集提取循环肿瘤DNA的方法

说明书

本发明提供了一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，属生物技术领域。本发明具体步骤如下：1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上样到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为100‑1000:1；2)采用5‑200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，3)采用5‑100倍柱体积的洗脱液洗脱得DNA；上述整个过程在10‑60℃进行。所述循环肿瘤DNA富集材料为双组分聚合物功能化材料。本发明方法在提取循环肿瘤DNA方面表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现对循环肿瘤DNA的有效分离和富集。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种富集提取循环肿瘤DNA的方法。

背景技术

循环肿瘤DNA，即ctDNA(circulating tumor DNA)，是指肿瘤细胞经过细胞凋亡或者坏死产生的DNA片段释放进入循环系统。ctDNA存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。由于ctDNA半衰期为1小时左右，能准确反映肿瘤当前情况，所以ctDNA可以作为组织活检的非侵入性替代方案。另外，ctDNA在癌症早期诊断、预后和测定药物治疗反应中发挥作用。

目前主流的ctDNA突变检测技术包括基于PCR扩增技术和基于DNA序列检测技术两类。但是不管哪种测序技术，都需要都对DNA进行富集和提取，以降低对扩增或者后续测序的干扰。

ctDNA的主要提取方法主要是基于硅球、磁性小球的固相萃取方法和基于苯酚-氯仿的液液提取方法。主要问题是提取效率和重现性。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种富集提取循环肿瘤DNA的方法。

一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：

1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为100～1000:1；

2)采用5-200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；

3)采用5-100倍柱体积的洗脱液洗脱得循环肿瘤DNA，洗脱液pH 10-12；

上述整个过程在10-60℃进行。

所述循环肿瘤DNA富集材料为双组分聚合物功能化材料。

所述双组分聚合物功能化材料，其结构如下：

其中R为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5。

所述双组分聚合物功能化材料基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。

所述双组分聚合物功能化材料的制备方法为：利用原子转移自由基聚合反应机制，将双组分功能共聚物接枝到无机半导体或金属或金属氧化物表面上，获得智能响应性聚合物功能表面；所述的无机半导体为Si或SiO₂，所述的金属为Au、Ag或Pt，金属氧化物为CuO、Al₂O₃、TiO2、ZrO₂或Fe₃O₄。