[发明专利]一种富集提取循环肿瘤DNA的方法

权利要求书

1.一种富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于采用柱固相萃取模式，具体步骤如下：

1)将循环肿瘤DNA富集材料装入移液枪枪头或者凝胶上样吸头中，形成微固相萃取柱，采用洗脱液和上样液活化及平衡微固相萃取柱，将生物样品溶解于上样液中，并上到微固相萃取柱上，循环肿瘤DNA富集材料与生物样品的质量比为100～1000:1；

2)采用5-200倍柱体积的淋洗液冲洗萃取柱，淋洗液pH 0-7；

3)采用5-100倍柱体积的洗脱液洗脱得循环肿瘤DNA，洗脱液pH 10-12；

上述整个过程在10-60℃进行；

所述循环肿瘤DNA富集材料为双组分聚合物功能化材料。

2.根据权利要求1所述富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料，其结构如下：

其中R为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；X＝0.01-0.5；

所述双组分聚合物功能化材料基底的材料为Si、Cu、Ag、Au、Pt、CuO、Fe₃O₄、多孔SiO₂、多孔Al₂O₃、多孔TiO₂或多孔ZrO₂中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。

3.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料的制备方法为：利用原子转移自由基聚合反应机制，将双组分功能共聚物接枝到无机半导体、金属或金属氧化物表面上，获得智能响应性聚合物功能表面；所述的无机半导体为Si或SiO₂，所述的金属为Au、Ag或Pt，金属氧化物为CuO、Al₂O₃、TiO2、ZrO₂或Fe₃O₄。

4.根据权利要求3所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料的制备方法具体为：在25mL的烧瓶中依次加入0.4mmol异丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能单体，二者摩尔比为4：1，同时加入6mL H₂O以及6mL DMF作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂CuBr 0.032g以及PMDETA或联吡啶配体0.16mL，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；将溴化处理过的Si,、SiO₂、Au、Ag、Pt、CuO、Al₂O₃、TiO2、ZrO₂或Fe₃O₄中的任意一种或者两种以上任意比例的混合物浸入配置好的反应溶液；将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4～6小时；反应结束后用DMF，H₂O依次洗涤聚合物接枝表面，得到双组分共聚物；此双组分共聚物的功能化表面的厚度为10-50nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。

5.根据权利要求4所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述硫脲功能单体结构式为：

6.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述双组分聚合物功能化材料材料的粒径是0.2-50μm,孔径为

7.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述生物样品为血液、滑膜液、脑脊液或尿液。

8.根据权利要求1所述的富集提取循环肿瘤DNA的方法，其特征在于所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇；有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，所述上样液中有机溶剂体积为10-50％，pH0-7。