[发明专利]一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法

说明书

本发明公开了一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：(1)采用水热法合成纳米四氧化三铁，采用硅烷偶联剂及戊二醛对所述纳米四氧化三铁进行修饰；(2)将脂肪酶和界面激活剂溶解于缓冲溶液中得到固定化溶液，将修饰后的纳米四氧化三铁作为载体加入到固定化溶液中进行固定化反应；所述界面激活剂包括吐温、蔗糖酯、正己醇、正己烷、曲拉通X‑100和十二烷基硫酸钠中的至少一种；(3)固定化反应结束后，向固定化溶液加入戊二醛进行交联，交联结束后分离、洗涤、干燥，得到固定化脂肪酶。本发明制备的固定化脂肪酶具有高效、稳定、分散性好和容易回收等优点。

技术领域

本发明涉及生物化工领域，尤其涉及一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法。

背景技术

脂肪酶(三酰甘油酰基水解酶，E.C.3.1.1.3)是自然界普遍存在的水解三酰基甘油酯键的酶。脂肪酶是一种广泛应用于食品、医药等化工行业的生物催化剂。脂肪酶具有“盖子”结构，其构象变化与脂肪酶的活化密切相关。在酶的封闭构象异构体中，活性位点完全埋在α螺旋的“盖子”下。脂肪酶“盖子”的打开，导致其活性中心的暴露，表现出催化活力，称为“界面活化”。

近年来脂肪酶在生物催化工业中的使用显著增长，特别是食品工业。但是，商业化脂肪酶的高成本以及低的操作稳定性被认为是推广脂肪酶大规模使用的主要制约因素。酶的固定化是规避上述缺点的一种相对较简单的方法。脂肪酶以及其他酶可以通过合理的固定获得更高的活力，更好的稳定性，选择性以及其他性能的改进。然而，酶的固定并不能很好的改善酶的性能。据报道，许多不适当的固定化过程导致了酶的性能的削弱，如活性损失(C.，et al.Immobilized heterologous Rhizopus oryzae lipase：A feasiblebiocatalyst for the production of human milk fat substitutes.BiochemicalEngineering Journal，2012，67：104-110；RedekerS.E.，et al.Protein engineering fordirected immobilization.Bioconjug Chem，2013，24(11)：1761-77.)。固定化过程中酶活力的降低可能是由于固定化过程中酶的构象发生了变化或者固定化酶的在催化反应中存在传质限制。对于脂肪酶，不适当的固定化过程时常导致固定化酶活力的损失，因为大多数固定是随机的，导致脂肪酶的“盖子”被掩盖。为了解决这个问题，提出了通过修饰蛋白进行定向固定以实现位点定向固定化(Blank K.，Morfill J.andGaub H.E.，Site-specificimmobilization of genetically engineered variants of Candida antarcticalipase B.Chembiochem，2006，7(9)：1349-51；Redeker S.E.，et al.，Proteinengineering for directed immobilization.Bioconjug Chem，2013，24(11)：1761-77.)。表面活性剂的添加可以打开脂肪酶的“盖子”并保持其打开的状态。脂肪酶可以以这种“盖子”打开的状态被固定化，使固定化酶的活性增加，这种方法被称为“分子印迹”。

目前纳米颗粒(碳纳米管，纳米尺寸二氧化硅，磁性纳米粒子等)在酶工程中的应用引起了人们的极大关注，它们为酶固定化提供了许多独特和有利的物理化学能力。其中，磁性纳米粒子(Fe₃O₄)由于其生物相容性好、稳定性好、比表面积大和超顺磁性而引起了人们极大兴趣。

发明内容

本发明提供了一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，制备的固定化脂肪酶具有高效、稳定、分散性好和容易回收等优点。

本发明提供了如下技术方案：

一种纳米四氧化三铁定向固定化脂肪酶的方法，包括以下步骤：