[发明专利]从脂肪中获取大量脂肪间充质干细胞的方法

权利要求书

1.分离和培养脂肪间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：

(1)将通过抽脂获取掺杂有膨胀液的脂肪样本置于离心管中，500~1000rpm离心2~5min；

(2)移除最上层油脂，并分别移取悬浮的脂肪颗粒和底层细胞沉淀，备用；

(31)向步骤(2)所得脂肪颗粒中以体积比1：0.8~1.2加入消化酶混合液，在37℃以100rpm振荡消化20~40min；消化结束后，加入等体积的完全培养基终止消化，1000~2000rpm离心3~8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(32)将步骤(2)所得底层细胞沉淀用PBS重悬，加入等量红细胞裂解液静置5~15min进行裂解；红细胞充分裂解后，1000~2000rpm离心3~8min，弃上清，PBS重悬细胞沉淀；

(4)合并步骤(31)和(32)所得细胞悬液，100μm滤网过滤，分离出作为原代的脂肪间充质干细胞；

(5)将分离出的原代脂肪间充质干细胞按照30000细胞/cm²接种至培养瓶进行培养，加入完全培养基，37℃ 5%CO₂培养；

(6)培养2天后换液，去除非贴壁细胞，待生长到一周时，收获P1代脂肪间充质干细胞；

(7)取少量细胞照步骤(5)和步骤(6)继续传代至下一代直至P5代，收获并观察各代次脂肪间充质干细胞，并进行相关检测，

其中，

步骤(1)中，所述膨胀液包含：0.1mg/ml利多卡因和0.02ug/ml肾上腺素；

所述消化酶混合液组成为：0.05%胶原酶I型、0.05%胶原酶II型、0.03%中性蛋白酶、0.03%DNA酶、0.0025%异丙醇；

所述完全培养基组成为：低糖型DMEM、10%FBS、25mM的HEPES、1μg/ml的EGF、2μg/ml的bFGF、0.02μg/ml的TGF-β、0.05μg/ml的IGF、0.05%山梨醇。

2.根据权利要求1的方法，步骤(1)中，以800rpm离心3min。

3.根据权利要求1的方法，步骤(31)中，脂肪颗粒与消化酶混合液以体积比1：1的比例加入。

4.根据权利要求1的方法，步骤(31)中，在37℃以100rpm振荡消化30min。

5.根据权利要求1的方法，步骤(31)中，终止消化后，以1500rpm离心5min。

6.根据权利要求1的方法，步骤(32)中，加入等量红细胞裂解液静置10min进行裂解。

7.根据权利要求1的方法，步骤(32)中，红细胞充分裂解后，1500rpm离心5min。

8.根据权利要求1的方法，其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行制剂的制备步骤。

9.根据权利要求1的方法，其中还包括使得到的P1代至P5代的任一代或多代的脂肪间充质干细胞进行细胞冻存的步骤，对所冻存的细胞进行复苏，对复苏的细胞进行制剂的制备。

10.根据权利要求1的方法，所述低糖型DMEM配方组成如下：无水氯化钙265mg、硝酸铁0.1mg、氯化钾400mg、无水硫酸镁97.67mg、氯化钠6400mg、无水磷酸二氢钠109mg、丁二酸75mg、丁二酸钠100mg、L-盐酸精氨酸84mg、L-盐酸胱氨酸63mg、甘氨酸30mg、L-盐酸组氨酸42mg、L-异亮氨酸105mg、L-亮氨酸105mg、L-盐酸赖氨酸146mg、L-甲硫氨酸30mg、L-苯丙氨酸66mg、L-丝氨酸42mg、L-苏氨酸95mg、L-色氨酸16mg、L-酪氨酸72mg、L-缬氨酸94mg、D-泛酸钙4mg、酒石酸胆碱7.2mg、叶酸4mg、肌醇7.2mg、烟酰胺4mg、核黄素0.4mg、盐酸硫胺4mg、盐酸吡哆辛4mg、葡萄糖1000mg、丙酮酸钠110mg、酚红9.3mg、水适量加至1000mL。