[发明专利]一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法

说明书

本发明公开一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，属于遗传工程技术领域。本发明首次建立了一种牛筋草的遗传转化体系方法，包括愈伤组织的诱导和继代、转化、诱导分化、生根筛选培养和炼苗移栽、转基因植株的PCR检测等步骤。该方法优点在于：(1)愈伤组织诱导率高，为遗传转化提供了大量的受体材料。(2)经过采用压力筛选培养基对抗性愈伤进行筛选和GUS鉴定对抗性植株进行筛选，简化了实验过程，大大减少了转化后的工作量。(3)利用传统的单子叶遗传转化方法，获得了稳定、高效的一种牛筋草遗传转化体系方法。

技术领域

本发明属于遗传工程技术领域，更具体涉及一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法。

背景技术

牛筋草(Eleusineindica)是禾本科一年生杂草，不仅分布广泛、适应能力强的特点，而且具有强的繁殖能力、分蘖能力强，已成为世界十大恶性杂草之一。由于除草剂的长期大量使用，目前已有265种杂草对15类除草剂产生了抗药性，而牛筋草已对7类除草剂产生了多重抗性。近年来，遗传转化法为抗病虫草害的研究提供了重要的技术手段。

迄今为止，有关牛筋草遗传转化体系的研究还未曾报道，这大大地限制了牛筋草抗药性研究的发展。所以，建立一种稳定、高效的牛筋草遗传转化体系，是研究牛筋草抗药性遗传机理的重要的方法手段。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法。该方法高效稳定，以成熟的敏感型牛筋草种子为外植体，建立其遗传转化体系。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导和继代：牛筋草种子去皮，-20℃冷冻20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒灭菌10～20min后，在无菌条件下，用无菌水反复清洗，风干，接入诱导培养基IC中；30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～ 3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24h黑暗。

(2)转化：将步骤(1)预培养得到的胚性愈伤组织低温处理后，接入 OD600＝0.4～0.6的目的农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，使农杆菌充分吸附到外植体上；将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转入共培养培养基CC上，进行共培养2～3d；取出共培养后的愈伤组织，脱菌、风干后转入筛选培养基SC1中筛选，30～40d后转入筛选培养基SC2上筛选；培养条件：25℃±2℃、24h黑暗培养。

(3)诱导分化：将步骤(2)筛选培养得到的愈伤组织，转接到分化培养基DC中，进行分化培养。

(4)生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC中；待幼苗根系发达时，炼苗，洗净根部琼脂凝胶，剪取转基因苗叶片和根部大约2～4cm，进行牛筋草组织GUS染色，将阳性苗移至基质中，12h 光照培养。

(5)转基因植株的PCR检测：提取步骤(4)得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否可扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到牛筋草转基因植株。

所述的诱导培养基IC：N6+0.5～2mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+ (30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。