[发明专利]一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法

权利要求书

1.一种根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)愈伤组织的诱导和继代：牛筋草种子去皮，-20℃冷冻20～30d后，于75％酒精浸泡，用0.05％～0.2％HgCl2消毒灭菌10～20min后，在无菌条件下，用无菌水反复清洗，风干，接入诱导培养基IC中；30～40d后，将产生的愈伤组织转入继代培养基AC中进行继代培养，每30～40d继代一次，继代2～3次；再进行预培养3～4d，选取淡黄色、结构紧凑、颗粒状的胚性愈伤组织作为后续的材料；培养条件：25±2℃、24h黑暗；

(2)转化：将步骤(1)预培养得到的胚性愈伤组织低温处理后，接入OD600＝0.4～0.6的目的农杆菌悬浮液中，“二次间歇抽真空”浸染，使农杆菌充分吸附到外植体上；将感染后的愈伤组织移至灭菌滤纸上，吸去表面液体后转入共培养培养基CC上，进行共培养2～3d；取出共培养后的愈伤组织，脱菌、风干后转入筛选培养基SC1中筛选，30～40d后转入筛选培养基SC2上筛选；培养条件：25℃±2℃、24h黑暗培养；

(3)诱导分化：将步骤(2)筛选培养得到的愈伤组织，转接到分化培养基DC中，进行分化培养；

(4)生根筛选培养和炼苗移栽：待不定芽长到4～6cm时，转入生根筛选培养基RC中；待幼苗根系发达时，炼苗，洗净根部琼脂凝胶，剪取转基因苗叶片和根部2～4cm，进行牛筋草组织GUS染色，将阳性苗移至基质中，12h光照培养；

(5)转基因植株的PCR检测：提取步骤(4)得到的阳性苗的基因组DNA，针对目的基因设计引物，采用PCR技术鉴定是否扩增出目的基因片段，若鉴定成功，即得到牛筋草转基因植株。

2.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的诱导培养基IC：N6+0.5～2mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。

3.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的继代培养基AC：N6+0.25～1mg·L-1 2,4-D+0.6～1g·L-1水解酪蛋白+3～4g·L-1植物凝胶+(30±1)g·L-1蔗糖+7～8g·L-1琼脂，pH＝5.8±0.1。

4.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：

所述的共培养培养基CC：诱导培养基IC+100～300μmol·L-1乙酰丁香酮AS，pH＝5.2±0.1。

5.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的筛选培养基SC1：诱导培养基IC+25～30mg·L-1潮霉素+300～400mg·L-1羧苄青霉素，pH＝6.0±0.1。

6.根据权利要求1所述的根癌农杆菌介导牛筋草的遗传转化方法，其特征在于：所述的筛选培养基SC2：诱导培养基IC+15～20mg·L-1潮霉素+200～300mg·L-1羧苄青霉素；pH＝6.0±0.1。