[发明专利]一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品

说明书

本发明公开了一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品。本发明提供了一种眼镜蛇毒的纯化方法，其包括以下步骤：(1)将含眼镜蛇毒的磷酸缓冲液进行阳离子交换层析，得到含活性成分的洗脱液A；所述的含眼镜蛇毒的磷酸缓冲液包括眼镜蛇毒和磷酸缓冲液；(2)将含活性成分的洗脱液A进行复合模式层析，得到含活性成分的洗脱液B；(3)将含活性成分的洗脱液B脱盐，得到活性成分。该纯化方法工艺简单，易于工业化，成本较低，且得到的产品纯度高、有关物质含量低。

技术领域

本发明涉及一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品。

背景技术

眼镜蛇毒是由蛇的毒腺分泌的一种天然蛋白质，含有多种蛋白质、多肽、酶类和其他小分子物质。而神经毒素(Cobrotoxin，简称NT)作为眼镜蛇毒的主要成分之一，其具有类似吗啡的中枢镇痛作用，用于顽固性疼痛、恶性肿瘤疼痛和关节痛的镇痛治疗，但镇痛效果好于吗啡，持续时间长，无成瘾性和耐药性，而且还能戒除吗啡毒瘾，因此在癌痛和戒毒方面具有独特的治疗作用，但两者却有截然不同的生物学特性。

1965年，杨振忠等通过阳离子交换纤维素CM-cellulose和Sephadex G-2_5首先从台湾眼镜蛇(Taiwan Cobra中分离出结晶毒蛋白，并命名为“cobratoxin，即眼镜蛇神经毒，并于1969年测定出cobratoxin的序列为:

LECHNQQSSQTPTTTGCSGGETNCYKKRWRDHRGYRTERGCGCPSVKNGIEINCCTTDRCNN，共62个氨基酸。(Yang CC,Yang HJ,Huang JS.The amino acid sequence of cobrotoxin[J}.Biochimica Biophysica Acta，1969,188:65)。

关于蛇毒神经毒素的提取纯化方法在科技文献、药学研究刊物等公开渠道已有相关报道，但普遍存在如生产成本高、生产周期长、质量难以控制、收率较低等技术问题。例如，专利CN101747409A中披露的分离提纯步骤为离心处理、经超滤膜、再用CMFF柱层析和凝胶柱层析，然而众所周知，超滤步骤的操作时间长、超滤膜昂贵，对蛇毒神经毒素的活性可能会有影响。专利CN105566482A披露了一种蛇毒神经毒素中科博肽的分离提取工艺，但pH值对其产品的纯度影响很大。专利CN102351951A披露的分离提取工艺为多次经滤膜过滤，而且产品含有盐，导致其工艺成本高、操作难度大、不易产业化。专利CN104327176A披露的分离提取工艺步骤为第一次阳离子柱层析、第二次阳离子柱层析、阴离子柱层析、凝胶过滤柱层析，而且每步之间都需要透析、很难进一步放大工艺、操作很麻烦。专利CN103387610A披露的分离提取工艺步骤采用SP-Sephodex-C25凝胶柱、Source S(XK5030)离子交换柱，最后超滤冻干，纯度仅93％。

现有国家药品质量标准中对单组份生物、生化药品的纯度要求通常为HPLC含量大于90％，科博肽(眼镜蛇神经毒素蛋白)国家药品标准(WS1-XG-009-2000)规定要求：按干燥品计算，神经毒蛋白含量不得少于35.0％；HPLC纯度检查主峰相对百分含量不得少于90.0％。而HPLC含量大于95％或更高的生物、生化单组份的高纯度的药物意味着制剂中与治疗作用无关的杂物质含量更少，这对于保证药品的质量、疗效、改善药物作用的时效、减少药物的毒副反应都具有重要意义。而药品原料的含量和纯度，在保证药品质量、疗效、安全性、用药剂型等方面具有决定作用。

综上所述，本领域对于眼镜蛇神经毒素存在进一步提高其纯度和实现工业化分离的需求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是现有眼镜蛇毒的纯化工艺繁杂、成本高、产品纯度低等缺陷，进而提供一种眼镜蛇毒的纯化方法及其产品。该纯化方法工艺简单，易于工业化，成本较低，且得到的产品(例如神经毒素)纯度高、有关物质含量低。

本发明提供了一种眼镜蛇毒的纯化方法，其特征在于，其包括以下步骤：