[发明专利]番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及兽用生物制品技术领域，进一步涉及疫苗的制备技术，具体涉及番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法。

背景技术

番鸭小鹅瘟病是1997年以来在福建省的番鸭饲养区爆发流行，目前全国各养鸭地区均有发生。临床上番鸭以腹泻、肠粘膜脱落形成栓塞为主要特征，发病率50-70％、死亡率40-60％。临床上使用番鸭细小病毒活疫苗及小鹅瘟高免卵黄抗体等均不能控制病情，给养鸭业造成较大的经济损失。

禽腺病毒分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ亚群，目前国内外专家学者主要对Ⅰ和Ⅲ鸭群进行研究。鸭腺病毒2型属于Ⅰ鸭群暂定种，最早是1977年匈牙利的J.F.Bouquet等在番鸭中分离的，它与已知的鸡和火鸡的病毒没有关系，但可在鸡和鸭的细胞中生长。近年来国内研究学者利用病毒宏基因组学相继从广东、福建等分离到该病毒，认为该病毒为一种鸭源新病毒。该病主要发生在20-30日龄鸭中，病鸭表现为精神萎靡、沉郁、排浅黄白色粪便，严重的甚至会死亡。病理症状为肝脏肿大、出血、白色点状坏死，胰腺白点坏死，心包积水，法氏囊缩小等。该病传播速度较快，很难清除，给养鸭业造成较大的经济损失。

番鸭源细小病毒和腺病毒均是番鸭的重要传染病，并且他们往往混合感染，给养鸭业造成较大的经济损失，然而目前尚无商业化的此类二联疫苗，究其原因是因为这两种抗原作为二联苗免疫动物时，免疫原性相互构成影响，往往难以同时对两种病毒达到免疫效果。

发明内容

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，以解决现有技术中缺乏此种疫苗的技术问题。

本发明要解决的另一技术问题是现有技术中以番鸭源细小病毒和腺病毒为抗原的二联疫苗难以同时对两种病毒产生有效免疫的技术问题。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，包括以下步骤：

1)取感染番鸭源鹅细小病毒的、9日龄番鸭，取其肝、脾或肠道组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为细小病毒液；

2)取感染鸭2型腺病毒的、16日龄番鸭，取其肝或脾组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为鸭2型腺病毒液；

3)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤1)所得的细小病毒液，10^-2稀释后接种于9～11日龄非免鸡胚，37℃培养，弃去24h非特异死胚，将24h-120h死胚置于4℃冷藏4-24h，收获尿囊液，将其在鸡胚上盲传3～5代，直至鸡胚出现致死，并且死亡时间控制在96h内，收获死胚尿囊液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的尿囊液待用；

4)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤2)所得的鸭2型腺病毒液，而后将其按细胞液体积的0.1-2％接种到长至单层状态的LMH细胞中，37℃培养72-96h，收获病毒，反复冻融3次，盲传3～5代，直至75％细胞出现病变，并且病变时间控制在72h内，收获病毒液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的病毒液待用；

5)利用超滤浓缩方法将步骤3)所得产物进行2.5倍体积浓缩，得到细小病毒抗原液；利用超滤浓缩方法将步骤4)所得产物进行2倍体积浓缩，得到鸭2型腺病毒抗原液；

6)分别灭活步骤5)所得的细小病毒抗原液和鸭2型腺病毒抗原液；

7)将灭活后的细小病毒抗原液和灭活后的鸭2型腺病毒抗原液分别以3500r/min转速离心10min，而后再分别经8层纱布过滤，过滤后等体积混合，再加入混合液体积4％的吐温80，混匀，得到疫苗水相；

8)取Marcol52白油，向其中加入1.2％(w/v)的硬脂酸铝，混合后加热，至硬脂酸铝完全溶解后向其中加入白油用量6/94(w/w)的司班80，边加热边搅拌至完全溶解，即得疫苗油相；

9)将步骤8)所得的疫苗油相与步骤7)所得的疫苗水相按3:2(w/w)的比例混合，乳化，即得到所述番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗。

作为优选，步骤3)所述病毒效价最高的尿囊液其番鸭源鹅细小病毒效价≥10^-5.5EID₅₀/0.1ml。

作为优选，步骤4)所述病毒效价最高的病毒液其鸭2型腺病毒效价≥10^-6.0TCID₅₀/0.1ml。