[发明专利]番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法

权利要求书

1.番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)取感染番鸭源鹅细小病毒的、9日龄番鸭，取其肝、脾或肠道组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为细小病毒液；

2)取感染鸭2型腺病毒的、16日龄番鸭，取其肝或脾组织，研磨后经8000rpm转速离心10min，取上清，即为鸭2型腺病毒液；

3)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤1)所得的细小病毒液，10^-2稀释后接种于9～11日龄非免鸡胚，37℃培养，弃去24h非特异死胚，将24h-120h死胚置于4℃冷藏4-24h，收获尿囊液，将其在鸡胚上盲传3～5代，直至鸡胚出现致死，并且死亡时间控制在96h内，收获死胚尿囊液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的尿囊液待用；

4)利用0.22μm孔径的滤器过滤步骤2)所得的鸭2型腺病毒液，而后将其按细胞液体积的0.1-2％接种到长至单层状态的LMH细胞中，37℃培养72-96h，收获病毒，反复冻融3次，盲传3～5代，直至75％细胞出现病变，并且病变时间控制在72h内，收获病毒液；按照同样方法繁毒5～8代，同时测定病毒含量，取病毒效价最高的病毒液待用；

5)利用超滤浓缩方法将步骤3)所得产物进行2.5倍体积浓缩，得到细小病毒抗原液；利用超滤浓缩方法将步骤4)所得产物进行2倍体积浓缩，得到鸭2型腺病毒抗原液；

6)分别灭活步骤5)所得的细小病毒抗原液和鸭2型腺病毒抗原液；

7)将灭活后的细小病毒抗原液和灭活后的鸭2型腺病毒抗原液分别以3500r/min转速离心10min，而后再分别经8层纱布过滤，过滤后等体积混合，再加入混合液体积4％的吐温80，混匀，得到疫苗水相；

8)取Marcol52白油，向其中加入1.2％(w/v)的硬脂酸铝，混合后加热，至硬脂酸铝完全溶解后向其中加入白油用量6/94(w/w)的司班80，边加热边搅拌至完全溶解，即得疫苗油相；

9)将步骤8)所得的疫苗油相与步骤7)所得的疫苗水相按3:2(w/w)的比例混合，乳化，即得到所述番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗。

2.根据权利要求1所述的番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤3)所述病毒效价最高的尿囊液其番鸭源鹅细小病毒效价≥10^-5.5EID₅₀/0.1ml。

3.根据权利要求1所述的番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤4)所述病毒效价最高的病毒液其鸭2型腺病毒效价≥10^-6.0TCID₅₀/0.1ml。

4.根据权利要求1所述的番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤5)所述超滤浓缩方法是利用100KD膜包实施的。

5.根据权利要求1所述的番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤6)中所述灭活包括以下操作：向抗原液中加入甲醛至终浓度为1～2‰(v/v)，摇匀，以180r/min转速、37℃条件下灭活16-20小时。

6.根据权利要求1所述的番鸭源鹅细小病毒、鸭2型腺病毒二联灭活疫苗制备方法，其特征在于步骤9)所述的乳化是利用弗鲁克公司出品的乳化机实施的，具体包括以下操作：取配方量的疫苗油相加入到容器内，开动乳化机至A档，加入配方量的疫苗水相，继续剪切2min，将乳化机置于B档，剪切3min。