[发明专利]一种四氢嘧啶的高效液相检测及含量测定方法

说明书

本发明提供了一种四氢嘧啶的高效液相检测及含量测定方法，色谱条件如下：色谱柱采用金刚烷键合相色谱柱，检测器采用DAD检测器，流动相包括流动相A和流动相B，流动相A是甲醇，流动相B是磷酸二氢钾缓冲水溶液，洗脱方式采用等度洗脱。利用上述色谱条件，通过将供试品溶液及标准品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，按外标法以峰面积计算，可以准确测定样品中四氢嘧啶的含量。本发明的方法检测时间短、分离效果好、精确度和准确度更高、成本更低，在四氢嘧啶生产菌株筛选以及相关定量研究等方面具有重要应用价值。

技术领域

本发明涉及分析化学领域，更具体地涉及一种四氢嘧啶的高效液相检测及含量测定方法。

背景技术

四氢嘧啶( 1，4，5，6-四氢-2-甲基-4-嘧啶羧酸；1，4，5，6-tetrahydro-2-methyl-4- pyrimidinecarboxylic acid；ectoine) 广泛存在于大多数中度嗜盐菌细胞内，是某些微生物应答环境渗透压胁迫所合成的具有渗透压补偿的环化氨基酸的衍生物。四氢嘧啶对保护细胞膜、胞内酶及蛋白有非常重要的作用，可作为化妆品保湿剂和酶蛋白稳定剂等。在食品工业、酶技术生产、基因工程、多聚体生产、生物医药、环境污染的生物修复等领域广泛的应用前景。

关于四氢嘧啶的HPLC分析方法及含量测定，现有技术已有报道采用C18反相色谱柱测定其含量，但四氢嘧啶在C18反相色谱柱不保留，同溶剂峰一同出峰，准确度较差。也有报道（贺冰,陶萍,陈爱连,施超欧.亲水相互作用色谱法测定中度嗜盐菌中四氢嘧啶和羟基四氢嘧啶.分析试验室.第35卷,第1期.93-96）用亲水性色谱柱Merck-SeQuant ZIC-HILIC( 150 × 4. 6mm，5 μm) 、流动相乙腈: 水( 0. 3% NH4H2PO4，pH 5) = 80: 20( V /V) ;流速: 1 mL /min; 检测波长:210 nm; 柱温: 30 ℃条件下分析，其四氢嘧啶保留时间在12分钟以上，时间较长，且分析成本较高。此外，专利CN105669560A也公开了一种测定四氢嘧啶纯度的方法，其中使用UltiMate 3000 Thermo Scientific高效液相色谱仪测定四氢嘧啶，色谱柱为TSK-GEL C18色谱柱，柱温30℃，流动相为2％乙腈，流速 1mL/min，紫外检测波长210nm，此方法中，尽管四氢嘧啶出峰时间快，但四氢嘧啶色谱峰同溶剂峰重合，准确度较差。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，提供一种检测时间短、分离效果好、精确度和准确度更高、成本更低的四氢嘧啶的高效液相检测方法及相应的四氢嘧啶含量测定方法。

基于上述问题，发明人提供了一种四氢嘧啶的高效液相检测方法。所述方法色谱条件如下：

色谱柱采用金刚烷键合相色谱柱（ADME色谱柱）；

检测器采用DAD检测器；

流动相包括流动相A和流动相B；流动相A是甲醇；流动相B是磷酸二氢钾缓冲水溶液（磷酸调pH）。

采用等度洗脱：流动相比例A:B为（0～10）：（100～90）。

在一个优选的实施例中，色谱柱柱长为250 mm。

在一个优选的实施例中，色谱柱柱温控制在25～40 ℃，更优选为30 ℃。

在一个优选的实施例中，检测波长为200～220 nm，更优选为204 nm。

在一个优选的实施例中，流动相比例A:B为5:95。

在一个优选的实施例中，流动相B中，磷酸二氢钾浓度为20 mM。

在一个优选的实施例中，流动相B的pH为2-6，更优选为3。

在一个优选的实施例中，流速为0.8～1.5 mL/min，更优选为1 mL/min。