[发明专利]酶法定量测定乳中乳过氧化物酶活性的方法及其试剂盒

说明书

本发明对酶法测定乳中乳过氧化物酶的方法进行改进，制备了稳定的标准品溶液，以及改善了乳品样品的前处理方法和后处理方法，解决了酶法定量检测乳中乳过氧化物酶活性中，标准曲线不稳定，样品检测的特异性和灵敏性不高的技术问题，并且提供了可用于本发明检测方法的完整试剂盒，方便了常规实验室开展乳中乳过氧化物酶活性的检测。

技术领域

本发明属于酶化学分析检测领域，具体来说涉及一种用于酶化学法定量检测乳中乳过氧化物酶活性的试剂盒、其制备方法以及相应的测定方法。

背景技术

乳过氧化物酶(Lactoperoxidase，EC 1.11.1.7，简称LP)是过氧化物酶家族的成员之一，是存在于乳汁中的一种血红素蛋白，由一条多肤链构成，包括612个氨基酸残基，分子量大约是78kD，等电点为9.6，是人乳和牛乳中非常常见的成份之一。

乳过氧化物酶和过氧化氢以及硫氰酸根(SCN)可以形成“乳过氧化物酶体系(LPS)”。这个酶系统具有抑菌活性，可以在没有冷藏的条件下，抑制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长，延长鲜乳的保质期，具有“冷杀菌”的作用。乳中的LPS不仅具有抗菌作用，还可预防过氧化氢等过氧化物的积累，从而避免了过氧化物引起的细胞损伤，起到保护乳腺的作用。在初乳中LP含量尤其丰富。此外，LP的破坏已经被作为巴氏灭菌效力的指标之一。

因此乳制品行业需要检测乳中LP的活性，用于鲜乳中LP活性的评价及保鲜措施的处理；也用于乳制品灭菌效力的评价，或者间接了解乳的热处理情况；通过测定LP活性了解某段时期内奶牛的健康状况等。

目前，国内外关于乳中乳过氧化物酶检测的方法不多，主要采用比色法如愈创木酚法、ABTS法或ELISA法等，这些方法都存在各种不足之处，例如检测过程复杂繁琐、检测结果准确性差等问题。另一方面，由于乳过氧化物酶标准品的准确含量不易确定，且乳过氧化物酶稳定性不高，制备的标准品溶液的含量不易保持稳定不变，也给乳中乳过氧化物酶的定量分析带来了不确定性。

此外，目前市场上可商购的乳过氧化物酶检测试剂盒基本是ELISA法的检测试剂盒。一方面，乳中含有种类繁多的酶，采用ELISA法定量检测其中的乳过氧化物酶，就不可避免存在酶之间的交叉反应；另一方面，乳中的蛋白质成分复杂，乳过氧化物酶相对于其他蛋白质而言含量极低，采用ELISA法测定对方法的灵敏性和特异性要求很高；并且由于所采用的乳过氧化物酶的抗体通常无法区分有活性的酶和已失活的酶，导致该方法对已钝化的酶也有一定程度的反应，从而使ELISA法检测的结果失真较严重。

乳品行业仍需开发适于乳过氧化物酶定量检测的方法及其检测试剂盒。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的发明人从标准品溶液的稳定性，样品处理方法等方面入手研究，解决了酶法定量检测乳中乳过氧化物酶活性的技术缺陷，从而完成了本发明。

本发明的第一个方面是提供一种乳过氧化物酶标准品溶液。该溶液能在2～8℃下长期保存而其中的乳过氧化物酶活性稳定。该溶液能在20～37℃下放置30天而其中的乳过氧化物酶活性稳定。解决了现有技术中乳过氧化物酶标准品溶液需要-20℃冷冻保存，反复冻融带来的检测不便，以及冻融过程中酶活性降低的问题，也解决了现有技术的乳过氧化物酶标准品溶液在检测温度下(一般为25～37℃)快速失活的问题。

一种乳过氧化物酶标准品溶液，其含有乳过氧化物酶，海藻糖，可溶性钙盐和水。

优选，其中各组分的含量比例为：乳过氧化物酶：海藻糖：可溶性钙盐以钙计＝1U：(0.125g～0.25g)：(0.00025g～0.002g)；更优选：乳过氧化物酶：海藻糖：可溶性钙盐以钙计＝1U：(0.15g～0.25g)：(0.001g～0.0015g)。

优选，乳过氧化物酶的含量为10U/L～800U/L。进一步优选为320～800U/L。最优选为400U/L。