[发明专利]一种抗凋亡的CHO细胞株及其用途

说明书

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗凋亡的CHO细胞株及其用途。本发明提供的抗凋亡的CHO细胞株含有Bcl2/shRNA‑Caspase3表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的细胞株更适应无血清培养条件，具有抵抗各种培养环境压力的抗凋亡能力；以该细胞株作为宿主细胞生产重组蛋白和抗体药物，能显著降低宿主细胞死亡率、延长产物收获时间、减少细胞碎片、提高产物产率和回收率。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种抗凋亡的CHO细胞株及其用途。

背景技术

细胞凋亡在细胞的生理和病理中发挥着重要的作用。然而在生物工程中，细胞凋亡却有着负面的影响。在蛋白的表达中，尤其是在高密度培养宿主细胞的过程中，机械的剪切力、气泡的表面张力、外源蛋白和细胞自身代谢产物的大量积累，常常导致宿主细胞的凋亡，而无法获得高的重组蛋白或抗体产量。

研究表明，Bcl2和Caspase3是凋亡过程中最重要的调控分子。Bcl2是抗凋亡蛋白，在Caspase3上游的关键调控点抑制Caspase3等凋亡效应分子的作用和Caspase3依赖的级联反应，并使细胞免于发生凋亡。Caspase3是Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一,在凋亡的执行阶段，Caspase3通过酶切不同的底物蛋白产生不同的生物效应，导致细胞凋亡的典型形态学改变。因此通过提高BCL2表达水平和沉默Caspase3基因有可能使细胞获得显著的抗凋亡效果，目前还没有相关的研究报道。沉默Caspase3基因采用的RNAi技术是转录后水平的基因沉默机制，具有高特异性、高效率、简单易行和成本低的特点。

中国仓鼠卵巢细胞是目前重组蛋白和抗体生产的首选体系，具有转录后修饰功能、细胞外分泌功能、可悬浮驯化和较少的内源蛋白分泌等优势。但CHO细胞培养成本高，相对于原核表达体系存在细胞结构脆弱、对培养条件要求很高、易于发生细胞凋亡的弱点。虽然已有一些方法可以对细胞凋亡产生一定的抑制效果，包括siRNA干扰Bax和Bak基因以及通过锌指核酸酶敲除Bax和Bak基因等，但是这些方法都不太彻底，效果并不理想。

发明内容

根据本发明的一个方面，本发明提供的抗凋亡的CHO细胞株，含有Bcl2/shRNA-Caspase3表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，所述细胞株构建方法包括以下步骤：

(1)构建Bcl2和shRNA-Caspase3双表达质粒pCHO/Bcl2/shRNA-Caspase3；

(2)将pCHO/Bcl2/shRNA-Caspase3转染悬浮CHO细胞株；

(3)在CD-Forti+Puromycin+MXT筛选培养基中进行加压筛选，得到混合克隆细胞；

(4)培养混合克隆细胞，挑取单克隆细胞；

(5)检测所述步骤(4)得到的单克隆细胞Bcl2表达量和Caspase3表达量，筛选得到所述抗凋亡的CHO细胞株。

进一步地，所述步骤(1)所述的Bcl2和shRNA-Caspase3双表达质粒pCHO/Bcl2/shRNA-Caspase3的构建方法包括以下步骤：

(1-1)采用RT-PCR法获取鼠Bcl2基因的cDNA序列，插入到pCHO1.0载体中，得到重组质粒pCHO/Bcl2；

(1-2)在鼠Caspase3基因外显子区的siRNA序列中选择siRNA结合位点序列；

(1-3)为所述步骤(1-2)的siRNA结合位点序列设计相应的shRNA引物，将引物连接到载体pSilencer2.1构建pS/shCaspase3重组质粒；

(1-4)所述步骤(1-3)所述的pS/shCaspase3重组质粒分别转染到CHO细胞；